http://repub.eur.nl/res/aut/21614/ List of Publications en http://repub.eur.nl/static-eur/img/logo.png http://repub.eur.nl http://repub.eur.nl/res/pub/20780/ 2010-09-24T00:00:00Z DNA is de drager van erfelijke eigenschappen van cellen, de bouwstenen van het lichaam. Beschadigingen in het DNA, veroorzaakt door bijvoorbeeld ioniserende en ultraviolette (UV) straling in zonlicht, moeten zo goed mogelijk hersteld worden omdat fouten in het DNA kunnen leiden tot het ontstaan van kanker. Tijdens de deling doorloopt de cel de celcyclus, waarin het erfelijke materiaal verdubbeld wordt en dit vervolgens verdeeld wordt over de twee dochtercellen. Om te voorkomen dat beschadigingen in het DNA doorgegeven worden aan de dochtercellen bestaan er controlemechanismen die continue het DNA afspeuren op beschadigingen. Bij de detectie van DNA schade worden deze controlemechanismen geactiveerd, zodat de celdeling wordt geblokkeerd om de cel tijd te geven het beschadigde DNA te herstellen. Wanneer cellen niet efficiënt reageren op DNA schade kan dit ten eerste lijden tot een versnelde celdeling. Ten tweede, door het niet correct repareren van DNA, kunnen er mutaties en breuken ontstaan. Beide zorgen voor een abnormaal functioneren van de cel met op een lange termijn tumorvorming tot gevolg. Een juiste reactie op DNA schade is daarom essentieel voor het voortbestaan van cellen en het organisme. Mijn proefschrift beschrijft de initiële respons van cellen op DNA schade. Door het analyseren van eiwitten die betrokken zijn bij de reactie op DNA schade in levende cellen met behulp van de microscoop zijn wij meer te weten gekomen over de regulatie van dit belangrijke proces. Onderzoek in de laatste decennia heeft aangetoond dat het ATR-Chk1 controlemechanisme (checkpoint) een belangrijke sleutel is in de reactie van cellen op DNA schade. Een veelvoud aan verschillende eiwitten zijn betrokken in deze eiwitcascade ofwel ‘pathway’. In Hoofdstuk 1 worden de verschillende componenten van de ATR-Chk1 pathway geïntroduceerd en hun functie besproken. Hoe het ATR-Chk1 en andere signaaltransductieroutes samenwerken met DNA reparatie mechanismen wordt beschouwd in Hoofdstuk 2. Tot op heden waren de eiwitten die betrokken zijn bij de ATR-Chk1 pathway vooral door middel van biochemische technieken onderzocht en er was nog maar weinig bekend over hoe deze eiwitten zich gedragen in levende cellen. Om dit te onderzoeken hebben wij verschillende eiwitten in de ATR-Chk1 pathway gelabeld met een fluorescerend eiwit genaamd GFP (groen fluorescerend eiwit). In Hoofdstuk 3 beschrijven wij de methode die is opgezet om dit te doen en om cellen te maken die deze eiwitten stabiel tot expressie brengen om ze zodoende geschikt te maken voor levende cel analyse onder de confocale fluorescentie microscoop. Door middel van deze stabiele cellijnen, het bleken van de fluorescentie en videomicroscopie (mobiliteitstudies) laten wij zien dat het ATRIP-ATR eiwit complex zich anders gedraagt na UV straling dan het Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1) complex. ATRIP lijkt zich sneller naar het beschadigde DNA te bewegen dan de eiwitten van het 9-1-1 complex. Beide complexen zijn betrokken bij het detecteren van DNA schade en het activeren van het controlemechanisme dat de celdeling tijdelijk blokkeert. De eiwitten die betrokken zijn bij DNA schade detectie hopen zich na het geven van schade 165 op in zogenaamde foci in de kern van de cel. Door middel van deze observatie bestuderen wij in Hoofdstuk 4 de relatie tussen celdeling en DNA reparatie mechanismen. De lokalisatie van Rad9 in de cel blijkt afhankelijk te zijn van het type DNA schade en de celcyclus fase waarin deze schade wordt veroorzaakt. In Hoofdstuk 4 gaan wij hier verder op in en laten zien dat na UV straling, in tegenstelling tot ioniserende straling, de ATR-Chk1 pathway niet wordt geactiveerd in de G2 fase van de celcyclus. De p38 signaaltransductieroute speelt hierbij een veel belangrijkere rol, wat laat zien dat verschillende controlemechanismen tijdens de celcyclus differentieel gereguleerd worden. In reactie op DNA schade is de ATR kinase verantwoordelijk voor de modificatie van Chk1. Dit proces is afhankelijk van het 9-1-1 eiwit complex. De modificatie van Chk1 zorgt ervoor dat de celcyclus wordt stopgezet om het DNA te repareren. In Hoofdstuk 5 onderzoeken wij deze gebeurtenis in detail door middel van mobiliteitstudies en laten zien dat de fosforylering van Rad17 door ATR nodig is voor een stabiele associatie van het 9-1-1 complex op beschadigd DNA, wat implicaties heeft voor de werking van het ATR-Chk1 controlemechanisme. Wij laten hiermee ook zien dat mobiliteitstudies een goede aanvulling zijn op bestaande biochemische technieken doordat zij het effect van kortdurende eiwit-eiwit interacties en eiwit modificaties op het gedrag van eiwitten laten zien. In Hoofdstuk 6 laten wij zien dat het 9-1-1 complex wordt gemodificeerd door ubiquitinering, en dan met name de Hus1 component van het 9-1-1 complex. Met behulp van massa-spectrometrie hebben wij het gemodificeerde aminozuur in Hus1 geïdentificeerd en ten slotte speculeren wij over welke eiwitten verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor deze modificatie. http://repub.eur.nl/res/pub/27376/ 2010-05-03T00:00:00Z To understand how multiprotein complexes assemble and function on chromatin, we combined quantitative analysis of the mammalian nucleotide excision DNA repair (NER) machinery in living cells with computational modeling. We found that individual NER components exchange within tens of seconds between the bound state in repair complexes and the diffusive state in the nucleoplasm, whereas their net accumulation at repair sites evolves over several hours. Based on these in vivo data, we developed a predictive kinetic model for the assembly and function of repair complexes. DNA repair is orchestrated by the interplay of reversible protein-binding events and progressive enzymatic modifications of the chromatin substrate. We demonstrate that faithful recognition of DNA lesions is time consuming, whereas subsequently, repair complexes form rapidly through random and reversible assembly of NER proteins. Our kinetic analysis of the NER system reveals a fundamental conflict between specificity and efficiency of chromatin-associated protein machineries and shows how a trade off is negotiated through reversibility of protein binding. http://repub.eur.nl/res/pub/28386/ 2010-04-01T00:00:00Z Cell cycle checkpoint activation and DNA repair pathways govern genomic stability after genotoxic stress. Genotoxic insult results in activation of an interwoven network of DNA damage checkpoints and DNA repair pathways. Post-translational modifications on a number of proteins involved in both checkpoint activation and DNA repair play an important role in this cellular response. Genotoxic stress can induce a wide variety of DNA lesions. Among these DNA alterations are double-stranded breaks and single-stranded DNA gaps. Repair of these DNA alterations requires damage recognition and resection. Here we discuss how DNA repair and DNA damage checkpoints cooperate and deal with DNA damage. Processing of DNA lesions by structure-specific nucleases results in DNA-protein intermediates, which form the basis for checkpoint activation and DNA repair. Post-translational modifications like phosphorylation and ubiquitination modulate the DNA damage response in a spatial and temporal manner. Cell cycle-dependent regulation additionally plays a key role in the regulation of both DNA repair and checkpoint activation. We highlight recent advances in in vivo imaging that greatly expand our knowledge on the relationships between DNA damage checkpoints and DNA repair. http://repub.eur.nl/res/pub/18014/ 2009-05-18T00:00:00Z Heterochromatin protein 1 (HP1) family members are chromatin-associated proteins involved in transcription, replication, and chromatin organization. We show that HP1 isoforms HP1-{alpha}, HP1-β, and HP1-{gamma} are recruited to ultraviolet (UV)-induced DNA damage and double-strand breaks (DSBs) in human cells. This response to DNA damage requires the chromo shadow domain of HP1 and is independent of H3K9 trimethylation and proteins that detect UV damage and DSBs. Loss of HP1 results in high sensitivity to UV light and ionizing radiation in the nematode Caenorhabditis elegans, indicating that HP1 proteins are essential components of DNA damage response (DDR) systems. Analysis of single and double HP1 mutants in nematodes suggests that HP1 homologues have both unique and overlapping functions in the DDR. Our results show that HP1 proteins are important for DNA repair and may function to reorganize chromatin in response to damage. http://repub.eur.nl/res/pub/28932/ 2008-12-01T00:00:00Z The cell cycle checkpoint kinase Chk1 is phosphorylated and activated by ATR in response to DNA damage and is crucial for initiating the DNA damage response. A number of factors act in concert with ATR to facilitate Chk1 phosphorylation, including Rad17-RFC, the Rad9-Rad1-Hus1 complex, TopBP1 and Claspin. Rad17 is required for loading of Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1) onto sites of DNA damage. Although phosphorylation of Rad17 by ATR is required for checkpoint function, how this affects 9-1-1 regulation remains unclear. We report that exposure of cells to DNA damage or replication stress results in Rad17-dependent immobilisation of Rad9 into nuclear foci. Furthermore, expression of mutant Rad17 that cannot be phosphorylated by ATR (Rad17AA), or downregulation of ATR, results in a decreased number of cells that display Rad9 foci. Photobleaching experiments reveal an increase in the dynamic behaviour of Rad9 within remaining foci in the absence of ATR or following expression of Rad17AA. Together, these data suggest a model in which Rad17 and ATR collaborate in regulating Rad9 localisation and association at sites of DNA damage. http://repub.eur.nl/res/pub/30199/ 2008-04-11T00:00:00Z In this issue of Molecular Cell, Barlow et al. (2008) show that not all DNA double-strand breaks are processed equally and that the chemical nature of DNA ends guides different paths to DNA repair.