Adhesion and Migration of Monocytes and Dendritic Cells in Type 1 Diabetes

SAMENVATTING VOOR NIET-INGEWIJDEN Type 1 diabetes, vroeger ook wel jeugddiabetes genoemd, wordt gekenmerkt door een afweerreactie gericht tegen de insuline-producerende ß cellen. Bij deze afweerreactie valt het afweersysteem (immuunsysteem) de lichaamseigen ß cellen in de alvleesklier aan en vernietigt deze. Deze afweerreactie waarbij het lichaam zichzelf aanvalt wordt een auto-immuunreactie genoemd. Als gevolg van deze auto-immuunreactie vermindert de productie van insuline, die belangrijk is voor de glucose huishouding binnen het lichaam. Door de verminderde insulineproductie schommelt de hoeveelheid glucose in het bloed, wat leidt tot verminderde functie van de bloedvaten en kans op complicaties. In de auto-immuunreactie tegen de ß cellen spelen een aantal type afweercellen een belangrijke rol. In dit onderzoek hebben wij ons met name op de rol van monocyten gericht. Monocyten worden gemaakt in het beenmerg, waarna ze in het bloed terechtkomen. Vanuit het bloed kunnen de monocyten de verschillende organen binnentreden. Zodra de monocyten een orgaan zijn binnengetreden, ontvangen ze allerlei signalen waardoor de monocyten zich verder ontwikkelen tot macrofagen of dendritische cellen. Macrofagen en dendritische cellen zijn gespecialiseerde afweercellen die in het lichaam bacteriën en resten van dode cellen opruimen en zorgen dat er een immuunreactie wordt gestart. Uit onderzoek met proefdieren, maar ook bij de mens, is gebleken dat in een vroege fase van diabetes ontwikkeling een ophoping van macrofagen en dendritische cellen te zien is in de alvleesklier. De ß cellen liggen in een soort eilandjes gegroepeerd, de zgn. eilandjes van Langerhans. Er vindt een ophoping plaats van macrofagen en dendritische cellen rondom deze eilandjes. Pas in een latere fase verschijnen er andere afweercellen bij de eilandjes, die infiltreren vervolgens de eilandjes en uiteindelijk worden dan de ß cellen vernietigd. Tenminste een deel van de macrofagen en dendritische cellen die zich in een vroege fase van diabetes ontwikkeling ophopen rond de eilandjes is afkomstig van monocyten uit het bloed. Men denkt dat de dendritische cellen in de alvleesklier lichaamseigen stoffen opnemen en bij vergissing een immuunreactie tegen het eigen lichaam starten, met als gevolg de vernietiging van de ß cellen. In mijn onderzoek, dat is beschreven in dit proefschrift, heb ik mij gericht op de functie van monocyten. Men denkt dat een verhoogd binnentreden van monocyten uit het bloed de alvleesklier in, de oorzaak is van de ophoping van macrofagen en dendritische cellen, die leidt tot de auto-immuunreactie en uiteindelijk diabetes. Het binnentreden van monocyten uit het bloed het weefsel in is een complex proces. Allereerst wordt de monocyt in het bloed afgeremd door de interactie van structuren die zich op de bloedvatwand bevinden met structuren op de monocyt. Door deze interactie remt de monocyt af en rolt deze over de wand van het bloedvat. Vervolgens bindt de monocyt met andere structuren aan moleculen op het bloedvat. Deze interacties tussen structuren op het bloedvat en op de monocyten zijn te vergelijken met de werking van klittenband. Deze laatste binding is dusdanig stevig dat de monocyt op de plaats blijft waar hij zit en niet meer meegesleurd kan worden door de bloedstroom. Hierna wringt de monocyt zich tussen de cellen van het bloedvat door, het weefsel in. Chemokinen zijn kleine eiwitten die door het weefsel geproduceerd worden. De monocyten kunnen deze herkennen met hun chemokinereceptoren. Deze herkenning geeft de monocyt een signaal dat die zich in die richting moet bewegen. De monocyt zal dus in de richting van de hoogste concentratie chemokine kruipen. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift heb ik de hechting en migratie van monocyten van type 1 diabetes patiënten bestudeerd. Hechting is de interactie tussen structuren op de monocyt met structuren op het bloedvat of op het weefsel en speelt een belangrijke rol bij het binnentreden van cellen het weefsel in. Hechting is ook een voorwaarde voor migratie. Migratie moet gezien worden als een dynamisch proces van vasthechten en weer loslaten met als resultaat het voortbewegen in een bepaalde richting, dit is vergelijkbaar met de voortbeweging dmv een rupsband. Monocyten gebruiken de extracellulaire matrix, dat is de matrix die cellen van het weefsel bij elkaar houden en het weefsel vorm geeft, als ondergrond om naar de juiste plek te migreren. Monocyten van type 1 diabetes patiënten bleken beter te kunnen hechten dan monocyten van gezonde vrijwilligers (hoofdstuk 2.1), terwijl de migratie naar bepaalde chemokinen slechter is (hoofdstuk 2.2). Een belangrijke factor bij de hechting van monocyten bleek het eiwit MRP8/14 te zijn. Dit eiwit was verhoogd aanwezig in het bloed van type 1 diabetes patiënten en kon een verhoogde hechtingscapaciteit bij monocyten induceren (hoofdstuk 2.1). Ook bleek hechting van monocyten een verhoogde uitscheiding van MRP8/14 door deze monocyten te veroorzaken bij monocyten van patiënten met type 1 diabetes (hoofdstuk 2.2). Het lijkt erop dat MPR8/14 betrokken is bij een positieve feedback mechanisme om een optimale hechting van monocyten te realiseren. Omdat het bij patiënten met type 1 diabetes niet mogelijk is de alvleesklier te bestuderen en het ook niet mogelijk is de pre-diabetes fase bij patiënten te onderzoeken, heb ik ook onderzoek gedaan met de non-obese diabetic (NOD) muis. De NOD muis is een veelgebruikt proefdiermodel voor type 1 diabetes omdat de ontwikkeling van diabetes geschiedt op vergelijkbare wijze als bij de mens. In hoofdstuk 3.1 heb ik de verschillende typen monocyten in het bloed bestudeerd. De NOD muis bleek naar verhouding meer rijpe monocyten te hebben dan controle muizen en tevens bleken deze rijpe monocyten een hoge hechtingscapaciteit te hebben, terwijl bij controle muizen de rijpe monocyten de hechtingscapaciteit hadden verloren. De onrijpe monocyten hadden bij zowel de NOD muis als bij controle muizen een hoge hechting. Ook bleek dat zowel de rijpe als onrijpe monocyten van de NOD bij voorkeur uitrijpten tot macrofagen, meer dan tot dendritische cellen. Zowel bij type 1 diabetes patiënten als bij de NOD muis bleek een hoge hechtingscapaciteit een kenmerk te zijn van de monocyten. Bij de mens vond ik ook een slechte migratie in type 1 diabetes. Toen ik dit bij de NOD muis onderzocht, bleek ook hier de parallel te bestaan. De NOD muis had een slechtere migratie van monocyten dan controle muizen. Dit heb ik onderzocht op 2 verschillende manieren: m.b.v. een steriele ontsteking in de buikholte en m.b.v. de zgn. air pouch (hoofdstuk 3.2). Bij een steriele ontsteking in de buikholte door injectie van de stof thioglycollaat kan men op verschillende tijden de afweercellen die de buikholte binnen zijn gegaan eruit halen en tellen. De NOD muis bleek in vergelijking met controle muizen niet goed in staat grote hoeveelheden monocyten uit het bloed aan te trekken de buikholte in. Bij het air pouch model werd op de rug van de muis op verschillende dagen steriele lucht geïnjecteerd, zodat er onderhuids een huidzak ontstond gevuld met lucht. In deze zak werd een chemokine geïnjecteerd waarna in de tijd het aantal afweercellen dat hierdoor aangetrokken werd, geteld kon worden. Ook in dit model bleek de NOD muis minder goed in staat grote aantallen monocyten te rekruteren. In de NOD muis vond ik dus ook een verminderde migratie van monocyten. Omdat monocyten belangrijke voorlopercellen zijn van dendritische cellen, heb ik ook de hechting en migratie van dendritische cellen in de NOD muis bestudeerd. Dit is beschreven in hoofdstuk 4.1. Ook de dendritische cellen van de NOD muis bleken beter te hechten en slechter te migreren dan dendritische cellen van controle muizen. Men dacht dat in type 1 diabetes de ophoping van macrofagen en dendritische cellen in de alvleesklier het gevolg was van een verhoogd binnentreden van monocyten uit het bloed. Mijn data wijst hier niet op. Om deze hypothese verder te weerleggen, heb ik ook in de alvleesklier van NOD muizen gekeken naar de hoeveelheid chemokinen tijdens de diabetes ontwikkeling. Hierbij heb ik ontdekt dat de zgn. pro-inflammatoire chemokinen, die heel goed monocyten uit het bloed aantrekken, pas laat tijdens de diabetes ontwikkeling verhoogd aanwezig zijn. De verhoogde aanwezigheid van deze pro-inflammatoire chemokinen viel samen met het binnentreden van andere type afweercellen. Deze cellen verschijnen pas als er al een ophoping van macrofagen en dendritische cellen in de alvleesklier is. Het is daarom niet waarschijnlijk dat dergelijke pro-inflammatoire chemokinen verantwoordelijk zijn voor een verhoogd binnentreden van monocyten als oorzaak van de ophoping van macrofagen en dendritische cellen. Veel eerder denk ik dat de verhoogde aanwezigheid van deze pro-inflammatoire chemokinen het gevolg is van de ophoping van macrofagen en dendritische celle

Type 1 diabetes is characterized by a T cell mediated destruction of the insulin-producing ß cells in the islets of Langerhans that are situated in the pancreas. Prior to the infiltration of lymphocytes into the pancreas, an accumulation of macrophages (mf) and dendritic cells (DC) is observed. It is generally thought that these mf and DC originate from blood monocytes that have entered the pancreas and have differentiated into mf or DC. On the basis of their normal physiological role, these cells presumably take up self-antigens and process these into peptides, which they present, after a so-called “steady-state” or “homeostatic” trafficking of the DC to the draining lymph nodes, to T lymphocytes in the para-cortical area. Normally this leads to tolerance induction and T regulatory cells are induced. However in the case of diabetes development, not regulatory T cells, but erroneously effector T lymphocytes become activated and islet autoimmunity is induced. These effector T cells that were primed in the lymph node, become re-activated after re-circulation upon recognition of the self-antigens in the pancreas and consequently – together with macrophages - initiate inflammation and mediate ß cell destruction, which is a hallmark of type 1 diabetes. In this thesis I have studied the processes involved in the early accumulation of mf and DC in the pancreas prior to the infiltration of lymphocytes. The extravasation of monocytes from the circulation into the pancreas is a complex process. Amongst other factors, adhesion molecules, chemokines and myeloid related proteins (MRPs) play an important role in the adhesive and migratory responses of the monocytes that enable effective extravasation. I studied the adhesive and migratory behaviour of human monocytes of type 1 diabetic patients and compared these functions with those of monocytes of type 2 diabetic patients and healthy control subjects. First of all, I was not able to detect any differences between patients and control subjects regarding the subdivision of circulating monocytes in mature and immature cells based on the expression of CD14 and CD16 (chapter 2.1). Secondly, monocytes of patients with type 1 diabetes displayed an intrinsically increased surface expression of the pro-inflammatory molecule MRP8/14 and an increased serum level of MRP8/14. When monocytes were allowed to adhere to the extra cellular matrix component fibronectin the cells showed an enhanced expression and production of MRP8/14. The monocytes of type 1 diabetes patients showed the strongest expression and production of MRP8/14 which was significantly increased over that of healthy control monocytes (chapter 2.2). Furthermore, such activated type 1 diabetic monocytes showed an even stronger adhesion to fibronectin, which was indeed found to be the effect of exposition of the monocytes to MRP8/14 (chapter 2.1). My findings suggest a positive feedback mechanism regarding the adhesive capacity of monocytes in type 1 diabetes: circulating monocytes express and secrete higher levels of MRP8/14 as compared to healthy control subjects, resulting in increased MRP8/14 in the serum. The increased serum MRP8/14 induces an increased adhesive capacity to fibronectin of the monocytes, which leads to an even larger secretion of MRP8/14 compared to healthy controls. In this thesis I also describe that the increased MRP8/14 in the serum induced an increased expression of CD11b/CD18 on the monocytes that is likely involved in the increased adhesion of the type 1 diabetic monocytes to endothelial cells that I observed (chapter 2.2). After the adhesion studies I investigated the migratory behaviour of monocytes of type 1 diabetes patients and observed a remarkably decreased response towards the pro-inflammatory chemokines CCL2 and CCL3. Both the transendothelial migration (measured in a Transwell system) and the chemotaxis (measured in the classical Boyden assay) towards these pro-inflammatory chemokines were decreased for monocytes in type 1 diabetes. In contrast, the chemotaxis of monocytes of type 1 diabetes patients to the constitutively in lymphoid-tissue expressed CCL19 was increased in comparison to healthy controls (chapter 2.2). Since in human subjects it is not feasible to study the diabetes development in the pre-diabetes stage, I also studied the adhesive and migratory capacity of monocytes of the NOD mouse, a widely used spontaneous animal model for type 1 diabetes, before the actual development of lymphocytic insulitis. Unlike patients, NOD mice showed increased numbers of mature (in the mouse Ly-6Clow) monocytes in the circulation and a preferential differentiation of monocytes towards mf (chapter 3.1). In contrast to control mice, NOD mice did not down regulate the fibronectin adhesive capacity of their monocytes upon maturation and the NOD Ly-6Clow monocytes displayed an increased adhesion to fibronectin as compared to the NOD Ly-6Clow monocytes of control mice. Hence a shared feature of monocytes of human type 1 diabetic subjects and NOD mice is an increased adhesive capacity to fibronectin (chapters 2.1 and 3.1). With regard to the migratory potential of monocytes in NOD mice, I studied the in vivo recruitment of monocytes in response to inflammation using two models. In the peritonitis model, in which a sterile inflammation is induced in the peritoneum by injection of thioglycollate, the recruitment of monocytes was severely decreased as compared to control mice to various pro-inflammatory stimuli (chapter 3.2). Also in the air pouch model (a model in which sterile air is injected subcutaneously on the back of the mouse, creating a body cavity in which chemokines can be injected) the monocyte recruitment to the pro-inflammatory chemokines CCL2 and CCL3 was severely hampered (chapter 3.2). Like for adhesion these findings show a parallel between NOD mice and type 1 diabetes patients: in both situations monocytes show a poor reaction to pro-inflammatory chemokines. I also studied the expression of chemokines in the pancreas of NOD mice during the development of diabetes. An increased expression of the pro-inflammatory chemokine CCL2 could never be detected as compared to control mouse strains. The expression of the pro-inflammatory chemokines CCL5 and CXCL10 was found only to be expressed in the NOD pancreas at a higher level at a later stage of the insulitis, i.e. at the time of the infiltration of T and B lymphocytes, hence after the early accumulation of the mf and DC (chapter 4.1). At the time of the early mf and DC accumulation an increased expression of the lymphoid tissue-related chemokines CCL19 and CCL21 was observed. Interestingly DC of NOD mice showed in vitro a decreased migration to the lymphoid tissue-related chemokine CCL19 (chapter 4.1), but an increased adhesion to fibronectin. NOD monocytes were not tested for their chemotactic response towards this chemokine. It is likely that the increased adhesion to endothelial cells and fibronectin and the altered response of monocytes (and DC) to pro-inflammatory and constitutively expressed chemokines are variables determining the enhanced accumulation of mf and DC in the pancreas in the early stages of the diabetic process. My findings suggest that particularly the increased adhesion of the cells to fibronectin may lead to a retention of mf and DC in the pancreas. There the mf and DC may contribute to an inflammatory environment by the production of e.g. TNF-a. Such local inflammatory environment induces the expression of pro-inflammatory chemokines by the ß cells and likely also by the mf and DC. Indeed we observed an increased expression of pro-inflammatory chemokines in the NOD pancreas at stages in which already an accumulation of mf and DC was observed. The infiltration of T and B lymphocytes correlated with the expression of these pro-inflammatory chemokines. Our data hence suggest that the inflammatory environment in the pancreas of NOD mice is rather the consequence of the accumulating mf and DC than the cause. Both human and mouse monocytes showed a decreased migratory response towards pro-inflammatory chemokines, suggesting that an inflammatory-driven influx of monocytes as the origin of the early mf and DC accumulation in the pancreas is not likely. It could be that the monocytes use the lymphoid tissue-related chemokines CCL19 and CCL21 as an alternative route to enter the pancreas. It could also be that these chemokines are involved in the formation of secondary lymphoid tissue as have been previously been described in the NOD mice and the RIP-LCMV model for diabetes. The precise role of CCL19 and CCL21 in the development of diabetes is not clear, but it provides an interesting subject for further investigation. In conclusion, in this thesis I show an interesting parallel between the adhesive and migratory behaviour of human and mouse monocytes in type 1 diabetes, providing evidence for a relation between the aberrant adhesive and migratory capacity of monocytes and DC and the development of type 1 diabetes. The mechanisms whereby an increased fibronectin adhesion and altered migration of the monocytes and DC triggers the autoimmune process need to be investigated further, providing a new and interesting challenge.