Pathogenesis of Rotavirus Infection

Rotavirussen maken deel uit van de familie van de Reoviridae en danken hun naam aan de vorm van de virus deeltjes zoals die met een elektronenmicroscoop kunnen worden waargenomen. De deeltjes lijken op een wiel met spaken, vandaar de naam rota wat in het Latijn wiel betekent. Rotavirussen zijn de belangrijkste veroorzakers van ernstige en soms levensbedreigende virale gastro-enteritis en diarree bij de mens. Symptomen zoals koorts, overgeven, diarree en uitdroging worden voornamelijk waargenomen bij jonge kinderen onder de 5 jaar. Rotavirus wordt verspreid via de ontlasting en komt via de mond het lichaam weer binnen. Jaarlijks sterven wereldwijd naar schatting gemiddeld 440.000 kinderen onder de 5 jaar ten gevolge van een rotavirus infectie. Dit houdt in dat wereldwijd 1 op de 293 kinderen die geïnfecteerd worden met rotavirus hieraan sterven. Hierbij moet dan worden opgemerkt dat veruit de meeste slachtoffers vallen in ontwikkelingslanden. De sterke ziektegerelateerde morbiditeit en mortaliteit maakt het noodzakelijk een beter inzicht te krijgen in het ontstaan van symptomen en het ziekteverloop tijdens een rotavirus infectie. Bovendien is de ontwikkeling van een effectief vaccin van groot belang. Er zijn tot nu toe verscheidene vaccins ontwikkeld op basis van eiwitten die de buitenste laag van het virus vormen (VP4 en VP7), maar helaas is er op dit moment geen effectief vaccin tegen rotavirus beschikbaar. In 1999 werd in de Verenigde Staten licentie verleend aan een tetravalent rotavirus vaccin (Rotashield). Dit vaccin werd echter al na enige maanden uit de handel genomen vanwege een verhoogde incidentie van intussusceptie (invaginatie of instulping van de darm) die gecorreleerd bleek te zijn aan de vaccinatie. Ondanks de hoge prevalentie van rotavirus infecties en de vele uitgebreide studies in verschillende diermodellen, is het inzicht in de mechanismen die leiden tot ziekte beperkt. Het onderzoek dat in dit proefschrift wordt beschreven richt zich in het bijzonder op verschillende factoren die leiden tot rotavirus geïnduceerde ziekte en symptomen. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de literatuur betreffende de mechanismen die betrokken zijn bij rotavirus pathogenese. Het dunne darm epitheel bestaat uit verschillende celtypen waaronder enterocyten en slijmbekercellen (goblet cellen). Enterocyten zijn betrokken bij de vertering, opname en transport van voedingstoffen (zoals suikers en vetten) en deze cellen worden door het rotavirus geïnfecteerd. Slijmbekercellen produceren en scheiden eiwitten zoals mucines uit die belangrijk zijn voor de bescherming van het epitheel. Het mucine Muc2 bijvoorbeeld is de belangrijkste component van de beschermende slijmlaag in de darm. Het darmepitheel wordt constant vernieuwd en de darmcellen ontstaan uit stamcellen die gelegen zijn in darm instulpingen (crypten). Deze cellen migreren dieper de instulping in of in de richting van de darmholte waar de darm vlokken (villi; deze uitstulpingen zorgen voor een vergroting van de oppervlakte van het darmepitheel) zich bevinden (voor een overzicht van een crypt en villus zie figuur 1 in hoofdstuk 7). Tijdens deze migratie differentiëren de cellen tot de verschillende gespecialiseerde celtypen van het darmepitheel. De gespecialiseerde en gedifferentieerde cellen in de crypt en op de darmvlokken gaan na verloop van tijd dood of worden in de darmholte uitgestoten en vervangen door jongere cellen. Op deze manier is er een constante aanmaak en aanstroom van nieuwe cellen. Het is de homeostase van de epitheelcellen waar het rotavirus op ingrijpt. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift gebruiken we een muizenmodel om het effect van rotavirus infectie op darm homeostase en disfunctie te bestuderen. In dit onderzoek werden 7-dagen oude zogende muisjes geïnfecteerd met een muizen rotavirus. De replicatie van het virus vond plaats in twee pieken, namelijk op dag 1 en dag 4 na infectie. De histologische en morfologische veranderingen werden gekarakteriseerd door het ontstaan van vacuoles in de 132 Chapter 8 enterocyten. We vonden dat door de infectie het aantal apoptotische cellen (celdood) en delende cellen was toegenomen. Bovendien was in geïnfecteerde muizen de snelheid verhoogd waarmee het darmepitheel werd vernieuwd. Het gevolg van deze veranderingen was dat de diepte van de crypten toenam en de darm villi (vlokken) korter werden en daardoor de totale oppervlakte van het darmepitheel kleiner werd. In rotavirus geïnfecteerde enterocyten werd een sterke afname gevonden van de expressie (op zowel eiwit- en RNA niveau) van specifieke eiwitten die betrokken zijn bij de opname en het transport van suikers, zouten, vetten en water. Verschillende factoren, zoals de uitschakeling van genexpressie in enterocyten samen met het verlies van gedifferentieerde enterocyten door apoptose en de vervanging van deze cellen door minder gedifferentieerde cellen, zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor een gebrekkige opname functie van het darmepitheel. Deze gebrekkige opname functie levert vervolgens een belangrijke bijdrage aan het ontstaan van diarree tijdens een rotavirus infectie. Veel rotavirus stammen gebruiken siaalzuur residuen, die aanwezig zijn op verschillende moleculen in de celmembraan als een soort opstapplaats voor binding aan de gastheercel. Ook veel mucines waaronder Muc2 bevatten veel siaalzuur residuen en er wordt aangenomen dat deze siaalzuren erg belangrijk zijn voor de rotavirus remmende eigenschappen die mucines bezitten. In hoofdstuk 3 hebben we de rol die slijmbekercellen en mucines spelen bij de bescherming van het darmepitheel tegen een rotavirus infectie geëvalueerd. We laten zien dat tijdens een rotavirus infectie in jonge muizen de slijmbekercellen, in tegenstelling tot enterocyten, niet massaal in apoptose gaan. Bovendien vonden we dat de expressie van intestinale mucine Muc2 was verhoogd tijdens infectie met rotavirus en dat de structuur van deze mucines was veranderd, wat er op duidt dat mucines en in het bijzonder Muc2 een belangrijke rol spelen bij de bescherming tegen infectie. We laten tevens zien dat leeftijdsafhankelijke verschillen in de samenstelling van mucines en een verhoogde aanwezigheid van sterk gesialyleerde mucines tijdens infectie een rol spelen bij hun beschermende capaciteit. De resultaten suggereren dat posttranslationele veranderingen in de glycosylering en sialylering van mucines tijdens rotavirus infectie hun beschermende capaciteit kunnen veranderen. Dit kan uiteindelijk een invloed hebben op de barrière functie van de slijmlaag tegen darm pathogenen. Hoofdstuk 4 beschrijft een onderzoek naar de rol van prostaglandines (PGs) in de toename van mucine expressie tijdens rotavirus infectie. We vonden dat de expressie van cyclooxygenase 2 (Cox2) mRNA, een eiwit dat essentieel is voor de synthese van PGs, sterk verhoogd is tijdens infectie in muizen. Dit impliceert tevens dat er tijdens infectie zeer waarschijnlijk ook een verhoogde productie van PGs moet zijn geweest. In geïnfecteerde muizen werden verhoogde niveaus van Muc2, Muc3 en Muc5AC mRNA gemeten. Om de rol van PGs in de transcriptie van mucines te bestuderen werd gebruik gemaakt van 2 celkweek modellen. Als een model voor enterocyten werd de humane colon adenocarcinoma cellijn Caco-2 gebruikt. Net als in geïnfecteerde muizen kwam het mucine MUC3 mRNA verhoogd tot expressie tijdens een rotavirus infectie. De PGs PGE1 en PGE2 waren in staat om MUC2 and MUC3 specifieke mRNA niveaus te verhogen in LS174T cellen. Deze cellen werden gebruikt als model voor slijmbekercellen. De expressie van MUC5AC werd in mindere mate verhoogd door PGE1 en helemaal niet door PGE2. Dit suggereert dat de inductie van dit mucine tijdens rotavirus infectie in muizen niet uitsluitend wordt bewerkstelligd door PGs, maar ook door andere mediatoren en mechanismen. De bevindingen in hoofdstuk 4 impliceren dat de inductie van mucine expressie tijdens een rotavirus infectie in ieder geval deels het gevolg zijn van de door rotavirus verhoogde niveaus van Cox2 en PGs. De meeste rotavirus vaccins worden ontwikkeld op basis van zogenaamde heterologe virussen voor de mens. Dit houdt in dat de mens normaal gesproken geen gastheer is voor deze virussen. Kennis over heterologe infecties in diermodellen zoals de muis is meestal beperkt tot de inductie van diarree en het meten van de aanwezigheid van het virus in de ontlasting. Replicatie van heterologe virussen wordt zelden bestudeerd en bevestigd in het darmweefsel. Daarentegen wordt een toegenomen hoeveelheid (infectieus) virus in de ontlasting gebruikt als maat voor replicatie in de darm. In hoofdstuk 5 is onderzocht of er verschillen bestaan in de afweerreactie na infectie met een muizen rotavirus (EDIM stam) als model voor een natuurlijke infectie en een heteroloog apen rotavirus (SA11 stam) als model voor vaccinatie. Voor de heterologe infectie werden drie verschillende fracties van het SA11 virus (met verschillende samenstelling) gebruikt die waren verkregen met behulp van cesium chloride gradiënt zuivering. EDIM en alle drie geteste fracties van SA11 bleken in staat om diarree te veroorzaken in jonge muizen, terwijl fecale uitscheiding van het virus alleen werd waargenomen bij het EDIM virus. In tegenstelling tot EDIM, werd er met behulp van verschillende technieken geen replicatie van SA11 gedetecteerd in het dunne darmweefsel van geïnfecteerde muizen. Er bestaan dus grote verschillen in de mate van virus replicatie en het (mogelijke) weefsel tropisme van het homologe EDIM virus en het heterologe SA11 virus. Dit gegeven is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het feit dat er werd aangetoond dat de specifieke mucosale afweerreactie (ontwikkeling van IgA antilichamen) niet tot stand komt na de heterologe infectie, dit in tegenstelling tot de homologe infectie. Het EDIM virus en de drie verschillende SA11 fracties induceerden dezelfde hoeveelheid IgG. De rotavirus specifieke IgG1/IgG2a ratio verschilde echter tussen de verschillende SA11 fracties. Dit betekent dat het type immuun respons (Th1/Th2) dat wordt opgewekt tegen een heteroloog virus afhankelijk is van de exacte samenstelling van het inoculum dat gebruikt is voor de infectie van de muizen. Het is derhalve van groot belang om met deze factoren rekening te houden met betrekking tot de ontwikkeling van nieuwe rotavirus vaccines. Het rotavirus genoom codeert voor zowel eiwitten die een onderdeel uitmaken van het virus deeltje (structurele eiwitten), als eiwitten die geen deel uitmaken van het virus maar alleen tot expressie komen als het virus zich vermenigvuldigt in de gastheercel (niet structurele eiwitten). De niet structurele eiwitten spelen een belangrijke rol bij de morfogenese en vermenigvuldiging van het virus. Eén van de niet structurele eiwitten, NSP4, is recentelijk geïdentificeerd als het eerste virale enterotoxine. NSP4 is in staat om diarree te veroorzaken als het in de buikholte of in de darm van jonge dieren wordt ingespoten. De inductie van diarree door NSP4 is leeftijdsafhankelijk en lijkt in die zin op de leeftijdsafhankelijke diarree veroorzaakt door een rotavirus infectie. Deze gegevens tonen aan dat NSP4 dus voor een belangrijk deel verantwoordelijk is voor de diarree die ontstaat tijdens een rotavirus infectie. In hoofdstuk 6 is onderzocht met welke cellulaire eiwitten NSP4 een interactie aangaat. Die eiwitten spelen mogelijk een rol bij het ontstaan van diarree. Met behulp van de zogenaamde two-hybrid techniek in gist cellen, waarmee eiwit interacties kunnen worden aangetoond, vonden we twee extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, laminine-ß3 en fibronectine. De interactie van deze twee eiwitten met NSP4 werd vervolgens ook aangetoond door middel van co-immuunprecipitatie. Bovendien kon NSP4 samen met laminine-ß3 in de basale 134 Chapter 8 membraan van geïnfecteerde muizen worden aangetoond. Dit duidt er op dat er een fysiologische interactie plaatsvindt. De binding van NSP4 aan extracellulaire matrix eiwitten in de basale membraan duidt er op dat NSP4 vrijkomt vanuit de basale kant van geïnfecteerde cellen. De beschreven bevindingen wijzen mogelijk op een nieuw mechanisme waarop rotavirus diarree en ziekte ontstaat. Hoofdstuk 7 tenslotte, geeft een opsomming en bediscussieerd de resultaten van de voorgaande hoofdstukken. De figuur in dit hoofdstuk geeft een overzicht van gevestigde en speculatieve gebeurtenissen die betrokken (kunnen) zijn bij het ontstaan van rotavirus pathogenese.