Handling of Oxalate and Calcium Oxalateby Renal Tubule Epithelial Cells

Nephrolithiasis (niersteenvorming) is een algemeen voorkomende ziekte in geïndustrialiseerde landen. Ongeveer één op de tien mensen zal tijdens zijn leven nierstenen ontwikkelen. Van de patiënten die voor de eerste keer een steen gevormd hebben zal ongeveer de helft dat binnen tien jaar nog een keer doen. Hoewel niersteenziekte niet levensbedreigend is kunnen stenen veel pijn veroorzaken en zijn de klinische procedures om ze te verwijderen erg ingrijpend. Niersteenvorming is een wijdverbreide ziekte, daarom hebben de klinische procedures en het daarmee samen­hangende werkverzuim een grote economische impact. Om die reden is het belangrijk de onderliggende afwijkingen van steenziekte bloot te leggen. Met deze kennis kunnen we mogelijk strategieën ontwikkelen om het terugkeren van een steen te voorkomen. Risicofactoren voor steenvorming zijn het voorkomen van stenen in de familie, voeding, voedingstekorten, levensstijl en onderliggende ziekten. Overmatige inname van zout, dierlijk eiwit en oxalaat verhogen de kans op steenvorming, net zoals onvoldoende inname van vocht, vezels en calcium. Specifieke dieetadviezen en/of farmacologisch ingrijpen kan voor sommige patiënten de kans op recidive voorkomen. In de nieren wordt geconcentreerde urine geproduceerd. Iedere dag wordt 180 liter vloeistof gefiltreerd aan de glomerulus. Tijdens dit proces worden essentiële voedingsstoffen en zouten teruggeresorbeerd met het grootste deel van het water en worden afvalstoffen uitgescheiden. De concentratie van stoffen die niet of slecht geresorbeerd worden neemt toe naar het einde van het nephron. Wanneer supersaturatie optreedt, d.w.z. wanneer de concentratie van zouten te hoog wordt om in oplossing gehouden te kunnen worden, kunnen zich spontaan kristallen vormen (nucleatie). Urine bevat normaliter bestanddelen die de nucleatie, groei, agglomeratie of retentie van kristallen beïnvloeden. Nierstenen kunnen gevormd worden wanneer kristallen niet met de urine uitgescheiden worden, maar achterblijven in de nier. Er bestaan verschillende theorieën over de retentie van kristallen in de nier. Volgens de “fixed particle” theorie blijven kristallen groeien en samenklonteren tot ze te groot worden om door het lumen van de tubulus te passeren en blijven steken. Volgens de “free particle”theorie, daarentegen, zou het achterblijven van kristallen afhankelijk kunnen zijn van de interactie tussen het epitheel van het niertubuli en de kristallen, zelfs als deze klein zijn. Het epitheel is ontvankelijk geworden voor kristalbinding, wat onder pathologische omstandigheden kan gebeuren. Urine bestanddelen kunnen invloed uitoefenen op de interactie tussen kristallen onderling en tussen kristallen en het epitheel. In hoofdstuk 2 hebben wij het remmende effect van urinebestanddelen op de binding van CaOx kristallen aan een ontvan­kelijk epitheel onderzocht. Hyaluronzuur (HA) was al eerder geïdenti­ficeerd als belangrijk kristalbindend molecuul in MDCK-I cellen tijdens migratie en proliferatie. Om die reden hebben we de rol van HA uitge­breider bestudeerd in meerdere cellijnen (hoofdstuk 3). Het lot van kristallen die aan het epitheel van de niertubuli gebonden zijn is afhankelijk van de oorsprong van dat epitheel. In de proximale tubuli komt het epitheel normaalgesproken niet in contact met kristallen en heeft daarom geen mechanisme ontwikkeld om achterblijven van kristallen te voorkomen. Kristallen die plakken aan dit celtype worden vervolgens in de cel opgenomen. Cellen uit de distale tubuli en verzamel­buizen komen daarentegen veelvuldig in contact met kristallen en zijn onder normale omstandigheden beschermd tegen kristalbinding. Het epitheel uit dit gedeelte van het nephron kan onder pathologische omstandigheden een kristalbindend fenotype tentoonspreiden. Zelfs onder die condities worden kristallen door deze cellen niet opgenomen ( hoofdstuk 4). Men gelooft dat CaOx kristallen die door cellen opgenomen worden fungeren als stressor en leiden tot activering of beschadiging van cellen. Wij hebben daarom de effecten onderzocht van blootstelling van confluente, op permeabele filters gekweekte, cellen aan een hoge dosis calcium oxalaat kristallen. De resultaten van onze studie wezen uit dat verzamelbuiscellen (MDCK-I), die beschermd zijn tegen kristalbinding, kristallen binden noch opnemen, noch een reactie op de kristallen vertonen. Cellen afkomstig uit de proximale tubulus (MDCK-II), binden CaOx kristallen en nemen deze op in de cellen, waarna een vroege en een late reactie onderscheiden kunnen worden. De vroege respons kenmerkt zich door een toegenomen uitscheiding van prostaglandine E2 (PGE2) en een groei reactie. Tegelijkertijd worden necrotische, kristallen bevat­tende, cellen losgelaten. Na deze onmiddellijke respons keert de PGE2 uitscheiding terug naar het oorspronkelijke niveau en blijven de cellen die kristallen bevatten in de normaal functionerende monolaag. De COM kristallen brengen acute ontsteking en necrose in proximale tubulus cellen teweeg, maar veroorzaken geen weefselschade in verzamel­buiscellen (hoofdstuk 5). Calcium oxalaat (CaOx) is het meest voorkomende bestanddeel van nierstenen. De opl

Nephrolithiasis (renal stone disease) is a common disorder in industrialized countries. About 10% of the population will develop kidney stones during lifetime. Approximately 50% of the patients that formed a renal stone for the first time will do that again within a period of 10 years. Although renal stone disease generally is not life threatening, stones can be very painful and invasive clinical interventions are required for their removal. Since nephrolithiasis is such a widespread disease, clinical procedures and the allied absence from work have a substantial economical impact. For that reason, it is important to disclose the abnormalities underlying stone disease. With this knowledge we might be able to develop strategies to prevent stone recurrence. Risk factors for stone formation are a positive family history of stones, nutrition, nutritional deficiencies, life style and associated diseases. Excessive intakes of salt, animal protein and oxalate, as well as insufficient intake of fluid, vegetable fibres and calcium increase the risk of stone formation. Specific dietary advice and/or pharmacological interventions can lower the risk of recurrence for some patients. In the kidneys, concentrated urine is produced. Each day, 180 litres of fluid are filtered at the glomerulus. During this process, essential nutrients and salts are reabsorbed together with most of the water and waste products are excreted. The concentration of components that are not or less extensively reabsorbed rises towards the end of the nephron. When super saturation occurs, i.e. when the concentration of salts gets too high to be kept in solution, crystals can spontaneously be formed (nucleation). Urine normally contains compounds that interfere with the nucleation, growth, agglomeration or retention of crystals. Renal stones can be formed when crystals are not eliminated with the urine, but are retained in the kidney. Different theories exist about the retention of crystals in the kidney. According to the “fixed particle” theory, crystals grow and aggregate until they become too large to pass through the tubular lumen and become e trapped. In contrast, according to the “free particle” theory, crystal retention could be dependent on the interaction between the renal tubular epithelium and the crystals, even when those are small. The epithelium has to become susceptible to crystal binding, which might occur under pathological conditions. Urinary constituents can influence the interaction between crystals and between crystals and the epithelium. In Chapter 2, we investigated the inhibitory effect of urinary components on CaOx crystal binding to a susceptible epithelium. Crystal binding was studied using renal tubular epithelial cell lines with characteristics from different parts of the nephron. Since hyaluronan (HA) was earlier identified as major crystal binding molecules in MDCK-I cells during migration and proliferation, the role of HA in crystal binding was more extensively investigated in different cell lines (Chapter 3). The fate of crystals that have been bound to the renal tubular epithelium varies depending on the origin of the epithelium. Proximal tubular epithelium usually does not encounter crystals and do not display defence mechanisms against their retention. Crystals that are retained by this cell type are subsequently internalized. In contrast, distal tubule/collecting duct cells often come in contact with crystals and are normally protected against crystal binding. The epithelium from this part of the nephron can be turned into a crystal-binding phenotype during pathological conditions. Even then, crystals are not internalized by this cell type ( Chapter 4). It is believed that CaOx crystals that are taken up by renal tubular epithelial cells act as stressor, leading to cell activation or injury. For this reason, we investigated the effects of long-term exposure of confluent renal tubular epithelial cells grown on permeable supports to a high dose of CaOx crystals (32 µg/cm2). Our studies showed that collecting tubule cells (MDCK-I), that were protected against crystal binding, did not bind take up or respond to crystals. Proximal tubular cells, by contract, bound and internalized CaOx crystals, after which an early and a late response could be distinguished. The early response was characterized by an increased secretion of prostaglandin E2 (PGE2) and a proliferative response. At the same time, crystal-containing necrotic cells were released. After this immediate response, PGE2 levels declined to control levels and crystal-containing cells remained incorporated in the normal functioning monolayer. COM triggers acute inflammation and necrosis in proximal tubular cells, but do not induce tissue injury in collecting duct cells (Chapter 5). Calcium oxalate (CaOx) is the most common component of renal stones. The soluble amount of CaOx is about fourfold higher in normal urine than in water. Oxalate has a bigger influence on the soluble amount than calcium. Urinary oxalate is increased in many idiopathic stone formers. This might be ascribed to increased intestinal calcium absorption, increased bone resorption and decreased renal tubular calcium reabsorption. Oxalate is believed to be toxic to renal tubular epithelial cells. We investigated oxalate toxicity using our two-compartment cell culture model, comparing proximal tubular cells and collecting tubule cells. Contrary to our expectations, physiological oxalate concentrations did not exert damage to either cell type. At extreme supraphysiological concentrations, oxalate did induce morphological alterations, inflam­matory responses and cell death (Chapter 6).