Molecular Diagnosis and Prognosis of Bladder Cancer : towards the implementation of molecular markers in clinical practice

Het urotheelcelcarcinoom (UCC) van de urineblaas is een serieus gezondheidsprobleem. Wereldwijd is 3.2% van alle nieuwe kankerdiagnosen aan deze ziekte toe te schrijven. UCC is de 5e meest voorkomende vorm van kanker en de 9e meest voorkomende vorm van kanker gerelateerde sterfte. De meeste patiënten (± 75%) presenteren zich met oppervlakkig UCC (pTa-pT1). Er zijn twee dilemma's bij het begeleiden van deze patiënten. Als eerste kenmerkt het oppervlakkig UCC zich door een hoge kans op één of meerdere recidieven (55­85%), waarbij de meeste recidieven gevonden worden in het eerste jaar na een transurethrale resectie (TUR). Deze recidieven worden gedetecteerd door middel van urethro-cystoscopie (UCS), de gouden standaard, die elke 3-4 maanden na een TUR wordt verricht, vaak in combinatie met urine cytologie (UC) als hulpmiddel. Na een recidief vrije periode van twee jaar kan de frequentie van de controles verlaagd worden. UCS en UC worden in de dagelijkse praktijk routinematig toegepast. UCS is echter invasief, vervelend voor de patiënten en duur. UC wordt helaas gekenmerkt door een lage sensitiviteit, met name voor laaggradig UCC. Er is derhalve ruimte voor verbetering, dat wil zeggen de ontwikkeling van methoden om oppervlakkige blaaskanker recidieven in urine te diagnosticeren en/of een subgroep van patiënten aan te wijzen die minder vaak gecontroleerd zouden kunnen worden. Een tweede punt van zorg bij het begeleiden van patiënten met UCC is het voorkomen van progressie (10-15%) naar spier-invasief carcinoom waaraan de patiënt mogelijk kan overlijden. De mogelijkheid om onderscheid te maken tussen oppervlakkige tumoren met en zonder invasieve capaciteiten zou klinisch van grote importantie zijn. Carcinoma in situ (CIS), een vlakke, hooggradige (G3) variant van oppervlakkig UCC is met name geassocieerd met een slecht ziekteverloop. Ondanks alles is het voorspellen van prognose voor een individuele patiënt met behulp van klinische en pathologische variabelen zeer moeilijk. Oppervlakkig UCC van een meer kwaadaardig phenotype kan wellicht in een vroeg stadium van de ziekte beter behandeld worden door middel van een radicale cystectomie. Dit verklaart waarom betere voorspellers voor UCC progressie nodig zijn. Met de recente vooruitgang in de moleculaire biologie, is ook de research steeds meer gericht op het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan blaascarcinogenese. Moleculaire markers zouden kunnen helpen bij het oplossen van de hierboven beschreven dilemma's. Als deze markers additionele waarde blijken te hebben ten opzichte van de huidige klinische en pathologische parameters, dan zouden ze onderdeel kunnen worden van de dagelijkse klinische praktijk. Dit proefschrift gaat over deze twee dilemma's t.a.v. de zorg voor patiënten met UCC. Moleculaire markers voor diagnose in urine en prognose van UCC werden geanalyseerd in verschillende klinische kaders. Deel één bevat een korte introductie over UCC in het algemeen en beschrijft de opzet van dit proefschrift (hoofdstuk 1). In het tweede gedeelte van het proefschrift evalueerden we in verschillende klinische kaders de Microsatelliet analyse (MA); een test gebaseerd op PCR reacties met DNA uit het urinesediment. Hoofdstuk 2 geeft een overzicht van de waarde van de huidige urine markers voor de diagnose van een recidief UCC. De sensitiviteit (patiënten met een recidief en een positieve urine test gedeeld door alle patiënten met een recidief UCC) en specificiteit (patiënten zonder recidief en een negatieve test gedeeld door alle patiënten zonder recidief UCC) werden bepaald voor 18 urine markers. Alle urine markers in het overzicht hadden een hogere sensitiviteit maar een lagere specificiteit voor recidief UCC dan de conventionele cytologie. De sensitiviteit nam toe met tumorgraad. In deze meta-analyse die alleen studies over recidief ziekte bevatte, was de sensitiviteit van de MA 82% en de specificiteit 89%. We vonden een behoorlijk lagere sensitiviteit t.a.v. recidief UCC voor 13/18 urine markers in vergelijk met eerdere overzichtsartikelen waarbij geen onderscheid gemaakt is tussen primair en recidief UCC. De reden voor deze lagere sensitiviteit is waarschijnlijk een hoger percentage klein, pTa en laaggradig UCC bij recidief laesies t.o.v. primaire tumoren. Vooralsnog ontbreekt voldoende klinisch bewijs om het cystoscopische controle schema te wijzigen m.b.v. een urine marker. Hoofdstuk 3 bevat een fase II studie over MA van urine die uitgevoerd werd in een dwarsdoorsnede van 109 patiënten die de polikliniek bezochten voor een controle UCS. Eerdere studies uitgevoerd in andere klinische kaders en met een lager aantal patiënten hadden reeds laten zien dat MA veelbelovend was om UCC in urine te diagnosticeren. Deze studie werd uitgevoerd om te onderzoeken of MA ook in staat was UCC te diagnosticeren bij patiënten die onder controle waren na een TUR. MA detecteerde 18/24 recidieven. De niet gevonden recidieven waren kleine pTaG1 laesies. In 5 van de 9 gevallen waarbij geen tumor werd gezien bij UCS maar waarbij MA wel positief was, werd toch nog een UCC gevonden binnen 6 maanden na MA. Bij dezelfde patiënten bleek MA sensitiever (74%) dan de BTAstat test (56%) en conventionele UC (22%). Nadelen van de MA waren de exclusie van 7 patiënten vanwege een onvoldoende hoeveelheid DNA in het urinesediment en 9 patiënten vanwege teveel leukocyten in de urine. Desondanks bleek MA een betrouwbare moleculaire test in urine om een recidief UCC te vinden, soms zelfs voordat er bij cystoscopie een recidief gezien werd. Hoofdstuk 4 gaat over MA in combinatie met de Fibroblast Groei Factor Receptor 3 (FGFR3) mutatie, een genetische marker voor gunstig UCC. Deze studie werd uitgevoerd om te onderzoeken of het mogelijk was de sensitiviteit van de MA te verhogen door de FGFR3 mutatie analyse eraan toe te voegen. De tests werden uitgevoerd op tumor- en urine monsters van 59 UCC patiënten waardoor er een directe vergelijking van de moleculaire veranderingen in tumor en urine mogelijk was. Conventionele cytologie werd gebruikt als referentie en een volledig klinisch rapport was beschikbaar van iedere patiënt. De UCCs met een hoger stadium en graad hadden meer microsatelliet veranderingen per tumor. Daarentegen werden FGFR3 mutaties alleen gevonden bij pTaG1-2 laesies. De sensitiviteit van de MA alleen was voor FGFR3 positief en negatief UCC respectievelijk 71% en 91%. Wanneer een microsatelliet verandering in tumor werd aangetoond, dan was de kans om dezelfde verandering ook in urine te vinden 35%. Dit was onafhankelijk van de FGFR3 status. De kans om dezelfde FGFR3 mutatie in urine te vinden was 52%. Veranderingen in de urine die niet in de corresponderende tumor gevonden werden, waren zeldzaam (1.8%). Door het combineren van de FGFR3 mutatie met de MA kon de sensitiviteit van moleculaire cytologie verbeterd worden tot 89% zonder daling van de specificiteit. De overeenkomst tussen de moleculaire profielen van urine en tumor in deze studie onderstrepen de clonale relatie van tumor cellen in de urine en de originele tumor(en). De waarde van de MA voor patiënten die gecontroleerd worden na bestraald te zijn op hun blaas is onderzocht in hoofdstuk 5. De controle van deze patiënten verloopt min of meer op dezelfde wijze als bij patiënten met oppervlakkig UCC. UCS en UC zijn echter vaak moeilijk te interpreteren na radiotherapie. Om die reden werd deze bijzondere groep patiënten getest m.b.v. MA. Hoewel er slechts 6 recidieven gevonden werden bij 49 patiënten, ontdekte de MA er 5 van. De specificiteit van routine UC, MA en expert UC was respectievelijk 85%, 93% en 97%. Daarnaast was de negatief voorspellende waarde van MA (echt negatieve MA / alle negatieve MA uitslagen) 99% (70/71 urine monsters) bij deze groep. Dit laatste is met name interessant omdat de positief voorspellende waarde van de UCS (40% in deze serie) veel lager is na bestraling. De resultaten van deze studie laten zien dat de MA ook van waarde kan zijn bij patiënten die gecontroleerd worden na bestraling. Het derde deel van dit proefschrift gaat over de prognostische waarde van de FGFR3 mutatie bij UCC. De relatie van deze mutatie met een gunstig ziektebeloop en de relatie tot andere klinische variabelen en moleculaire markers werd bediscussieerd. Hoofdstuk 6 bevat een overzicht van de klinische, pathologische en moleculaire kenmerken van het (oppervlakkig) UCC. Het laatste gedeelte van dit hoofdstuk geeft een korte inleiding over het FGFR3 gen. De hoofdstukken 7 & 8 bevatten de eerste twee publicaties over het gunstige karakter van de FGFR3 mutatie bij het UCC. Een FGFR3 mutatie werd gevonden bij 70/98 (71%) van de pTaG1-2 UCC. Aan de andere kant had slechts 7% van de invasieve G3 tumoren zo'n mutatie. Verder was de mutatie afwezig in 20 gevallen van CIS wat ook weer wijst op het gunstige karakter van de FGFR3 mutatie bij het UCC. Witte bloedcellen en biopten van normaal urotheel bij patiënten met een FGFR3 mutatie in hun tumor lieten geen FGFR3 mutaties zien. Dit benadrukte het somatische karakter en de tumorspecificiteit van deze mutaties voor UCC. De FGFR3 mutatie was tevens geassocieerd met een lage recidief-frequentie van oppervlakkig UCC in het eerste jaar na een TUR. Bij 57 patiënten met oppervlakkig UCC, was slechts 6% van de UCS positief voor de patiënten met een FGFR3 mutatie. Dit was 28% voor de patiënten die geen FGFR3 mutatie in hun tumor hadden. Deze twee preliminaire studies maakten duidelijk dat FGFR3 het eerste gen is dat vaak gemuteerd is bij gunstig (pTaG1-2) UCC. Daarnaast suggereren de resultaten uit deze twee hoofdstukken dat de frequentie van UCS behoorlijk verlaagd zou kunnen worden voor de patiënten met FGFR3 positieve tumoren. In hoofdstuk 9 worden de resultaten van een grote, retrospectieve, multicentrische studie getoond. Het doel van deze studie was het vergelijken van de FGFR3 mutatie met andere moleculaire markers en het verkrijgen van een lange klinische follow-up. Tevens werd de reproduceerbaarheid van de pathologische graad en de moleculaire variabelen bepaald. De FGFR3 mutatie werd in deze studie van 286 patiënten met primair UCC vergeleken met de expressie van drie immunohistochemische markers (MIB-1, P53 en P27kip1) waarvan het bekend is dat ze correleren met prognose. Een FGFR3 mutatie werd gevonden bij 172/286 (60%) van de UCCs. G1 tumoren hadden een mutatie in 88% van de gevallen, G3 tumoren in 16%. Daarentegen werden aberrante expressie niveaus van MIB-1, P53 en P27kip1 gevonden bij respectievelijk 5%, 2% en 3% van de G1 tumoren en 85%, 60% en 56% van de G3 tumoren. De combinatie van FGFR3 en MIB-1 was significant in de multivariaat analyse met als eindpunten recidief frequentie, progressie en ziekte vrije overleving. Het verschil in klinisch beloop met betrekking tot progressie van oppervlakkig UCC was evident t.a.v. de combinaties FGFR3 mutatie / MIB-1 normaal (N=138) en FGFR3 wild type / MIB-1 verhoogd (N=47). Het was interessant dat de overige 61 patiënten met tumoren zonder FGFR3 mutatie en normale MIB-1 expressie of tumoren met een FGFR3 mutatie en tevens een hoge MIB-1 expressie, een nagenoeg identiek klinisch beloop hadden dat tussen de twee eerdere groepen lag en zich kenmerkte door een redelijke prognose. Dit resultaat stelde ons in staat een moleculair graderingsmodel voor UCC te propageren waarin 3 moleculaire graden te onderscheiden zijn (mG1-3): mG1 (goede prognose), mG2 (redelijke prognose) en mG3 (slechte prognose). Daarnaast was de moleculaire Graad reproduceerbaarder dan de pathologische graad (91% vs. 47-61%). Op basis van de hoofdstukken 7, 8 en 9 was het de conclusie dat de FGFR3 mutatie selectief de gunstige moleculaire “pathway” van papillair UCC karakteriseert. Verder is moleculair graderen een nieuw, eenvoudig en zeer reproduceerbaar instrument om de prognose van UCC te bepalen. Hoofdstuk 10 laat zien dat FGFR3 mutaties ook frequent voorkomen bij het papilloom wat een zeldzame afwijking van het urotheel is. Papillomen worden in het algemeen beschouwd als een aparte diagnostische entiteit vanwege hun benigne natuurlijk beloop. Daarom zijn ze ook in de 1998 World Health Organization / International Society of Urological Pathology consensus classificatie als zodanig geclassificeerd naast de papillaire urotheel-laesies met lage maligniteits potentie (PUN-LMP, G1) en de laaggradige papillaire urotheel carcinomen (LG-PUC, G1-2). In onze studie werden FGFR3 mutaties gevonden bij 9/12 papillomen en bij 68/79 pTaG1 laesies (na review geclassificeerd als PUN-LMP en LG-PUC in respectievelijk 62 en 17 gevallen). Naast papillomen van het urotheel werd de FGFR3 mutatie analyse ook verricht op 21 Brenner tumoren van het ovarium. Deze tumor werd gekozen vanwege de gelijkenis met laaggradig UCC vanuit cytologisch oogpunt. Desalniettemin werden er geen FGFR3 mutaties gevonden bij Brenner tumoren. Deze studie beschreef als eerste een genetisch defect bij papillomen van het urotheel. Verder suggereerden we dat vanuit een moleculair perspectief, de papillomen van het urotheel samen in één groep met alle andere goed gedifferentieerde tumoren van het urotheel geclassificeerd zouden moeten worden. Hoofdstuk 11 beschrijft de verdeling van FGFR3 mutaties en P53 over­expressie (als expressie niveau >10%) voor 260 patiënten met UCC. Zoals beschreven in de hoofdstukken 7 en 8, is het FGFR3 gen gemuteerd bij een hoog percentage van laaggradige UCCs. Het doel van deze studie was derhalve om de relatie tussen FGFR3 mutaties en over-expressie van het P53 tumor suppressor eiwit als uiting van een mutatie in het P53 gen te evalueren. De over­expressie van P53 en/of het mutant P53 gen zijn in eerdere studies beschreven als ongunstige markers m.b.t. het UCC. FGFR3 mutaties en P53 over-expressie zijn bij respectievelijk 59% en 25% van de tumoren gevonden. Samen beschrijven de FGFR3 mutatie en de P53 over-expressie 79% van de UCCs. Echter, veranderingen in FGFR3 en P53 kwamen slechts bij 5.7% van de UCCs tegelijkertijd voor. Omdat deze genetische veranderingen ook nog eens geassocieerd waren met tegenovergestelde klinische en pathologische parameters, opperden wij dat mutaties in FGFR3 en P53 twee verschillende genetische “pathways” in de pathogenese van UCC markeren. Hoofdstuk 12 geeft een overzicht van de verdeling van de FGFR3 mutaties die gevonden zijn in UCC en dezelfde mutaties in de kiembaan die verantwoordelijk zijn voor een grote verscheidenheid aan skelet afwijkingen. Bijna alle FGFR3 mutaties in eerdere studies m.b.t. UCC kwamen overeen met de mutaties die thanatophore dysplasie veroorzaken, een aangeboren afwijking die in het algemeen snel na de geboorte tot de dood leidt. Deze studie rapporteert enkele nieuwe FGFR3 mutaties bij UCC die gevonden zijn bij niet-lethale syndromen met skeletafwijkingen. Onder de voorwaarde dat de FGFR3 mutatie op zich voldoende is voor het aanmaken van een blaastumor, zou het dus wel eens zo kunnen zijn dat patiënten met een FGFR3 geassocieerde skeletafwijking en een relatief normale levensverwachting (bijvoorbeeld: Achondroplasie) een hogere kans hebben op het krijgen van blaastumoren in vergelijk met de algehele populatie.

Urothelial cell carcinoma (UCC) of the urinary bladder is a serious health problem. The disease accounts for 3.2% of all new cancer cases worldwide. UCC of the bladder is the 5th most common cancer and the 9th leading cause of cancer death. In most patients (± 75%), UCC is superficial (i.e. pTa-pT1) at first presentation. There are two problems in the management of these patients. First, superficial UCC of the bladder is characterized by a high risk of recurrence (55­85%), with most recurrences in the first year after trans-urethral resection (TUR). These recurrences are detected by urethro-cystoscopy (UCS), the gold standard, which is performed every 3-4 months, often in combination with urine cytology (UC) as an adjunct. After a two-year recurrence free period, the intensity of follow up may be lowered. UCS and UC are routinely used in the daily clinical practice. However, UCS is invasive, bothersome for the patients and costly. Unfortunately, UC is characterized by a low sensitivity, especially for low grade UCC. Hence, there is room for improvement, i.e. a need for development of techniques to diagnose superficial bladder cancer recurrences in urine and/or to identify a subset of patients who require a less frequent follow up. The second concern in managing patients with UCC is to prevent progression (10-15%) to muscle invasive, potentially lethal UCC. The ability to distinguish superficial tumors with invasive capabilities from those unlikely to become invasive would be of great clinical benefit. Carcinoma in situ (CIS), a flat and high grade (G3) manifestation of superficial UCC is especially associated with an unfavorable disease course. However, individual prediction of prognosis by clinical and pathological features is still very difficult. Superficial UCC that maintains a more malignant phenotype might be better treated with radical cystectomy in an early stage of the disease. This explains the need for more accurate predictors of UCC-progression. With the recent advances in molecular biology, research is more and more focusing on understanding the molecular mechanisms associated with bladder carcinogenesis. Therefore, molecular markers may aid in solving the two UCC management problems outlined above. If molecular markers prove to have additional value over the established clinico-pathological variables, they could become part of the clinical practice. This thesis deals with these two problems concerning the management of patients with UCC. Molecular markers for diagnosis in urine and prognosis of UCC were analyzed in various clinical settings. Part one gives a short introduction on UCC in general perspective and contains the scope of this thesis (chapter 1). In the second part of the thesis, we evaluated Microsatellite analysis (MA); a test based on PCR reactions with DNA of the urine sediment, in different clinical settings. Chapter 2 provides an overview of the accuracy of the current urine markers to diagnose recurrent UCC. The sensitivity (patients with a recurrent lesion and positive urine test divided by all patients with recurrent UCC) and specificity (patients without recurrence and a negative test divided by all patients without recurrent UCC) were determined for 18 urine markers. All the urine markers reviewed had a higher sensitivity, but a lower specificity than conventional cytology for recurrent UCC. The sensitivities increased with tumor grade. In this meta-analysis confined to studies on recurrent disease, MA had a sensitivity of 82% and a specificity of 89% for detection of UCC recurrences. We found a considerably lower sensitivity to detect recurrent UCC for 13/18 urine markers in comparison with earlier review articles where no distinction between primary and recurrent UCC was made. The reason for this reduced sensitivity is most likely a higher percentage of small, pTa and low grade UCC among recurrent lesions compared to primary tumors. At this time, sufficient clinical evidence to change the cystoscopic follow-up scheme with the use of a urine marker is not available. Chapter 3 describes a phase II study on urinary MA, which we performed in a cross-section of 109 patients who visited the outpatient department for a follow-up UCS. Earlier investigations in other clinical settings and with a limited number of patients showed that MA had a high potential to diagnose UCC in urine. Our study was conducted to investigate whether MA was also capable of diagnosing UCC in patients who were under surveillance after TUR. MA detected 18/24 recurrent tumors. The undetected UCCs were small pTaG1 lesions. In 5 of 9 cases where no tumor was seen at UCS but MA was positive, an UCC was found within 6 months after MA. In the same group of patients, MA was more sensitive (74%) than the BTAstat test (56%) or conventional urine cytology (22%). A drawback of MA was the exclusion of 7 patients due to an insufficient amount of DNA in the urine sediment and another 9 patients with leukocyte abundance. Nevertheless, MA appeared a reliable molecular test in urine for detection of recurrent UCC, sometimes even before cystoscopical evidence of the disease. Chapter 4 describes MA in conjunction with the Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (FGFR3) mutation, a genetic marker for favorable UCC. This study was initiated to explore the possibility to improve the sensitivity of MA by adding FGFR3 mutation analysis to the molecular marker panel. The tests were carried out on tumor- and urine samples of 59 UCC patients allowing a direct comparison of molecular changes in tumor and urine. Conventional cytology was used as a reference and a full clinical record of each patient was obtained. UCCs with a higher stage or grade had more microsatellite alterations per tumor. Conversely, FGFR3 mutations were only found in pTaG1-2 lesions. The sensitivity of MA in FGFR3 positive and negative UCC was 71% and 91%, respectively. When a Microsatellite alteration was detected in tumor tissue, the chance to find the same alteration in the urine was 35% regardless of FGFR3 status. The chance to find the same FGFR3 mutation in the urine was 52%. Additional alterations in the urine that were not present in the UCC were only seldom reported (1.8%). By combining the FGFR3 mutation with MA, the sensitivity of molecular cytology could be enhanced to 89% without compromising specificity. The similarity of the molecular profiles in urine and tumor corroborate the clonal relation of tumor cells in the urine and the original tumor(s). In chapter 5, the value of MA for patients under surveillance after radiotherapy was investigated. The follow up of these patients is more or less the same as for the patients with superficial UCC. However, UCS and UC are often difficult to interpret in case of previous radiotherapy. Therefore, MA was tested in this particular patient group. Although only 6 recurrences were found in the 49 patients, MA detected 5 of them. The specificity values for routine urine cytology, MA and expert urine cytology were 85%, 93% and 97%, respectively. In addition, the negative predictive value of MA (true negative MA / all negative MA) was 99% (70/71 urine samples) for this group. The latter is especially interesting because the positive predictive value of UCS (40% in this series) is much lower for irradiated patients. The results of this study indicate that MA may also be a useful tool for surveillance of patients who were previously treated by radiotherapy. Part three of this thesis focuses on the prognostic value of the Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (FGFR3) mutation in UCC. Its relation to favorable disease will be discussed as well as its relation to clinical variables and other molecular markers. Chapter 6 gives an overview of the clinico-pathological and molecular prognostic features in (superficial) UCC. The last part of this chapter gives a short introduction of the FGFR3 gene. The chapters 7 & 8 contain the first two papers published on the favorable nature of the FGFR3 mutation in UCC. The FGFR3 mutation was detected in 70/98 (71%) of pTaG1-2 UCC. Conversely, invasive G3 lesions had a mutation in only 7% of tumors. Moreover, the mutation was absent in 20 cases of CIS, again pointing to the favorable nature of the FGFR3 mutation in UCC. White blood cells and normal-looking urothelial biopsies of patients with a FGFR3 mutation in their bladder tumor lacked FGFR3 mutations. This emphasized the somatic nature and the tumor specificity of these mutations in UCC. The FGFR3 mutation was also associated with a low recurrence rate of superficial UCC in the fist year after a TUR. In 57 patients with superficial UCC, only 6% of UCS was positive for patients with a FGFR3 mutation. This was 28% for patients who had no FGFR3 mutation in their tumor. These two preliminary studies showed that FGFR3 is the first gene to be mutated at a high frequency in favorable (pTa G1-2) UCC. This mutation is the first genetic marker to selectively identify a large group of patients with favorable disease characteristics. Furthermore, the results presented in these two chapters suggest that the frequency of UCS can be reduced considerably for patients with FGFR3 positive tumors. In chapter 9 the results of a large, retrospective multi­center study are displayed. The purpose of this study was to compare the FGFR3 mutations to other molecular markers and to obtain long term clinical follow up. In addition, the reproducibility of pathological grade and molecular variables was determined. In this study of 286 patients with primary UCC, the FGFR3 mutation was related to the expression of three immunohistochemical markers (MIB-1, P53 and P27kip1) known to be associated with prognosis. FGFR3 mutations were detected in 172/286 (60%) of UCCs. G1-tumors had a FGFR3 mutation in 88% of cases, G3-tumors in 16%. Conversely, aberrant expression patterns of MIB-1, P53 and P27kip1 were seen in 5%, 2% and 3% of G1-tumors and in 85%, 60% and 56% of G3-tumors, respectively. In multivariate analysis with recurrence rate, progression and disease specific survival as endpoints, the combination of FGFR3 and MIB-1 proved of independent significance for all 3 disease parameters. With regard to disease progression of superficial UCC, the difference in the clinical course between UCC combining FGFR3 mutation / MIB-1 normal (N=138) and those combining FGFR3 wild type / MIB-1 high (N=47) was evident. Interestingly, the 61 remaining patients with tumors characterized by absence of FGFR3 mutation and normal MIB-1 expression or by a FGFR3 mutation and high MIB-1 expression behaved more or less the same representing an intermediate prognosis. These results led to the proposal of a molecular grading model for UCC distinguishing three molecular grades (mG1-3): mG1 (favorable prognosis), mG2 (intermediate prognosis) and mG3 (poor prognosis). Moreover, the molecular Grade was more reproducible than pathological grade (91% vs. 47–61%). Based on the observations in the chapters 7, 8 and 9, it was concluded that the FGFR3 mutation represents the favorable molecular pathway of papillary UCC. Furthermore, molecular Grading provides a new, simple and highly reproducible tool to determine UCC prognosis. Chapter 10 shows that FGFR3 mutations are also common in urothelial papilloma, a rare urothelial neoplasm. Papillomas are generally considered as a separate diagnostic entity because of their benign natural behavior. Therefore, they are currently classified apart from papillary lesions of low malignant potential (PUN-LMP, G1) and low grade papillary urothelial carcinomas (LG-PUC, G1-2) by the 1998 World Health Organization / International Society of Urological Pathology consensus classification. In our study, FGFR3 mutations were found in 9/12 papillomas and in 68/79 pTaG1 lesions (reclassified as PUN-LMP and LG­PUC in 62 and 17 cases, respectively). Besides urothelial papillomas, the FGFR3 mutation analysis was also performed for 21 ovarian Brenner tumors. This tumor was chosen for its resemblance to low grade UCC from a cytological point of view. However, no FGFR3 mutations were found in Brenner tumors. This report was the first to describe a genetic defect in urothelial papilloma and we suggested from a molecular perspective, that urothelial papillomas should be classified together with all well differentiated urothelial neoplasms. Chapter 11 describes the distribution of FGFR3 mutations and P53 over-expression (assumed if expression level >10%) for 260 patients in UCC. As described in the chapters 7 and 8, the FGFR3 gene is mutated in a high percentage of low grade UCCs. Therefore, the purpose of this study was to evaluate the relationship between FGFR3 mutations and over-expression of the P53 tumor suppressor protein as a manifestation of a mutation in the P53 gene. The over-expression of P53 and/or the mutant P53 gene have been reported in earlier studies as an unfavorable marker in UCC. FGFR3 mutations and P53 over-expression were observed in 59% and 25% of tumors, respectively. Together, the FGFR3 and P53 over-expression described 79% of UCC. However, alterations in FGFR3 and P53 coincided in only 5.7% of UCC. Because each of these alterations was also associated with opposite clinico-pathological parameters, it was proposed that mutations in FGFR3 and P53 mark two alternative genetic pathways in papillary UCC pathogenesis. Chapter 12 gives an overview of the distribution of FGFR3 mutations detected in UCC and the corresponding germline mutations, which are responsible for a wide variety of skeletal anomalies. Almost all FGFR3 mutations in earlier studies corresponded to the mutations that lead to thanatophoric dysplasia, a congenital disorder that is generally lethal shortly after birth. This study reported a few new FGFR3 mutations in UCC that matched non-lethal skeletal syndromes. Therefore, patients with skeletal syndromes associated with FGFR3 mutations and a relative normal life span (for example: achondroplasia) might be at a higher risk for development of bladder tumors than the general population provided that the FGFR3 mutation on its own is capable of bladder tumor formation.