Biological and Functional Analysis of the ATR Checkpoint Pathway

DNA is de drager van erfelijke eigenschappen van cellen, de bouwstenen van het lichaam. Beschadigingen in het DNA, veroorzaakt door bijvoorbeeld ioniserende en ultraviolette (UV) straling in zonlicht, moeten zo goed mogelijk hersteld worden omdat fouten in het DNA kunnen leiden tot het ontstaan van kanker. Tijdens de deling doorloopt de cel de celcyclus, waarin het erfelijke materiaal verdubbeld wordt en dit vervolgens verdeeld wordt over de twee dochtercellen. Om te voorkomen dat beschadigingen in het DNA doorgegeven worden aan de dochtercellen bestaan er controlemechanismen die continue het DNA afspeuren op beschadigingen. Bij de detectie van DNA schade worden deze controlemechanismen geactiveerd, zodat de celdeling wordt geblokkeerd om de cel tijd te geven het beschadigde DNA te herstellen. Wanneer cellen niet efficiënt reageren op DNA schade kan dit ten eerste lijden tot een versnelde celdeling. Ten tweede, door het niet correct repareren van DNA, kunnen er mutaties en breuken ontstaan. Beide zorgen voor een abnormaal functioneren van de cel met op een lange termijn tumorvorming tot gevolg. Een juiste reactie op DNA schade is daarom essentieel voor het voortbestaan van cellen en het organisme. Mijn proefschrift beschrijft de initiële respons van cellen op DNA schade. Door het analyseren van eiwitten die betrokken zijn bij de reactie op DNA schade in levende cellen met behulp van de microscoop zijn wij meer te weten gekomen over de regulatie van dit belangrijke proces. Onderzoek in de laatste decennia heeft aangetoond dat het ATR-Chk1 controlemechanisme (checkpoint) een belangrijke sleutel is in de reactie van cellen op DNA schade. Een veelvoud aan verschillende eiwitten zijn betrokken in deze eiwitcascade ofwel ‘pathway’. In Hoofdstuk 1 worden de verschillende componenten van de ATR-Chk1 pathway geïntroduceerd en hun functie besproken. Hoe het ATR-Chk1 en andere signaaltransductieroutes samenwerken met DNA reparatie mechanismen wordt beschouwd in Hoofdstuk 2. Tot op heden waren de eiwitten die betrokken zijn bij de ATR-Chk1 pathway vooral door middel van biochemische technieken onderzocht en er was nog maar weinig bekend over hoe deze eiwitten zich gedragen in levende cellen. Om dit te onderzoeken hebben wij verschillende eiwitten in de ATR-Chk1 pathway gelabeld met een fluorescerend eiwit genaamd GFP (groen fluorescerend eiwit). In Hoofdstuk 3 beschrijven wij de methode die is opgezet om dit te doen en om cellen te maken die deze eiwitten stabiel tot expressie brengen om ze zodoende geschikt te maken voor levende cel analyse onder de confocale fluorescentie microscoop. Door middel van deze stabiele cellijnen, het bleken van de fluorescentie en videomicroscopie (mobiliteitstudies) laten wij zien dat het ATRIP-ATR eiwit complex zich anders gedraagt na UV straling dan het Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1) complex. ATRIP lijkt zich sneller naar het beschadigde DNA te bewegen dan de eiwitten van het 9-1-1 complex. Beide complexen zijn betrokken bij het detecteren van DNA schade en het activeren van het controlemechanisme dat de celdeling tijdelijk blokkeert. De eiwitten die betrokken zijn bij DNA schade detectie hopen zich na het geven van schade 165 op in zogenaamde foci in de kern van de cel. Door middel van deze observatie bestuderen wij in Hoofdstuk 4 de relatie tussen celdeling en DNA reparatie mechanismen. De lokalisatie van Rad9 in de cel blijkt afhankelijk te zijn van het type DNA schade en de celcyclus fase waarin deze schade wordt veroorzaakt. In Hoofdstuk 4 gaan wij hier verder op in en laten zien dat na UV straling, in tegenstelling tot ioniserende straling, de ATR-Chk1 pathway niet wordt geactiveerd in de G2 fase van de celcyclus. De p38 signaaltransductieroute speelt hierbij een veel belangrijkere rol, wat laat zien dat verschillende controlemechanismen tijdens de celcyclus differentieel gereguleerd worden. In reactie op DNA schade is de ATR kinase verantwoordelijk voor de modificatie van Chk1. Dit proces is afhankelijk van het 9-1-1 eiwit complex. De modificatie van Chk1 zorgt ervoor dat de celcyclus wordt stopgezet om het DNA te repareren. In Hoofdstuk 5 onderzoeken wij deze gebeurtenis in detail door middel van mobiliteitstudies en laten zien dat de fosforylering van Rad17 door ATR nodig is voor een stabiele associatie van het 9-1-1 complex op beschadigd DNA, wat implicaties heeft voor de werking van het ATR-Chk1 controlemechanisme. Wij laten hiermee ook zien dat mobiliteitstudies een goede aanvulling zijn op bestaande biochemische technieken doordat zij het effect van kortdurende eiwit-eiwit interacties en eiwit modificaties op het gedrag van eiwitten laten zien. In Hoofdstuk 6 laten wij zien dat het 9-1-1 complex wordt gemodificeerd door ubiquitinering, en dan met name de Hus1 component van het 9-1-1 complex. Met behulp van massa-spectrometrie hebben wij het gemodificeerde aminozuur in Hus1 geïdentificeerd en ten slotte speculeren wij over welke eiwitten verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor deze modificatie.

• View at Worldcat

Free Full Text ( Final Version , 15mb )