Spatial organisation of the ß-globin locus

Alle multi-cellulaire organismen beginnen als een enkele bevruchte eicel. Gedurende de differentiatie wordt het aantal cellen vermeerderd door middel van celdeling. De cellen specialiseren zich tevens in verschillende celtypes zoals hersen-, bloed- en spiercellen. Toch bevatten al deze cellen dezelfde genetische informatie dat is opgeslagen in miljoenen base paren DNA, welke georganiseerd zijn in grote elementen die chromosomen worden genoemd. Een DNA sequentie die codeert voor een bepaalde overerfbare eigenschap (vaak een eiwit) wordt een gen genoemd. Het gehalte aan genen is gelijk in elke cel (ongeveer 25.000 genen). Het verschil tussen de diverse celtypes wordt daarom niet bepaald door de genomische opbouw van een cel maar juist hoe deze genomische opbouw gebruikt wordt, of anders gezegd; welke genen geactiveerd of juist onderdrukt worden. De activatie van genen wordt strak gereguleerd qua plaats en tijd en een gebrek aan juiste transcriptionele regulatie resulteert vaak in allerlei ziekten zoals b.v. kanker. Bij de juiste transcriptionele activatie van genen in hogere eukaryoten zijn verschillende regulerende DNA elementen betrokken; de promoter wordt vlakbij het gen gevonden terwijl andere elementen zoals enhancers zeer ver van het te activeren gen kunnen liggen. Een van de belangrijkste vragen in de moleculaire biologie is hoe deze zogeheten cis-regulerende elementen over deze aanzienlijke afstanden met de promoter van een gen kunnen communiceren. Verschillende mechanismen zijn voorgesteld voor deze communicatie: o.a. het looping model, het tracking model en het linking model. Deze modellen worden in hoofdstuk 1 in detail besproken. Een goed voorbeeld van een gespecialiseerde cel in zoogdieren is de rode bloed cel. Het meest voorkomende molecuul in rode bloedcellen is het zuurstof en kooldioxide transporterende hemoglobine dat opgebouwd is uit twee a-globine eiwitten, twee ß-globine eiwitten en vier heem groepen. Het ß-globine eiwit wordt gecodeerd door genen in het ß-globine locus. Het muizen ß-globine locus bevat vier ß-achtige genen. Twee daarvan, de embryonale ß-globine genen, komen in het embryo tot expressie terwijl de twee andere genen, de volwassen ß-globine genen actief worden in een later stadium van de ontwikkeling. De ß-achtige genen zijn langs de DNA streng gerangschikt in de volgorde van hun expressie. Een vitaal regulerend element, de locus control region (LCR) genoemd, ligt ongeveer 50 kb stroom opwaarts van het volwassen ßmajor gen, en verschillende ver weg gelegen elementen met een onbekende functie zijn geïdenti. ceerd. De meeste kennis over de organisatie van chromatine in de cel kern is verkregen via licht- en .uorescentie microscopie studies, maar ondanks dat er spectaculaire vooruitgang geboekt is in dit veld wordt de resolutie begrensd door optische limitaties. Daarom is het momenteel niet mogelijk om de structurele organisatie van een individueel gen locus, dat bijvoorbeeld 200 kilobasen genomisch DNA omspant, te visualiseren. Een ingewikkelde structurele organisatie op dit niveau van resolutie is echter te verwachten b.v. waar enhancers of andere regulerende elementen met ver weg gelegen promoters communiceren. Zoals in hoofdstuk 4 bediscussieerd wordt zijn er diverse nieuwe technieken ontwikkeld om de structurele organisatie van een individueel gen locus te bestuderen en één daarvan is Chromosome conformation capture (3C) technologie. Deze methode was oorspronkelijk ontwikkeld om de structuur van chromosomen in gist te bestuderen. Hoofdstuk 5 beschrijft hoe deze procedure geoptimaliseerd werd om de structurele organisatie van chromosomale regio’s in (de veel complexere) zoogdier cellen te bestuderen en hoe het toegepast werd om een chromosomale regio van 200 kb die het muizen ß-globine locus bevat in expresserende rode bloedcellen en niet expresserende hersen cellen te bestuderen. In hersencellen heeft het ß-globine locus een schijnbaar lineaire structuur. Maar in rode bloedcellen komt de ß-globine LCR ruimtelijk in de naburigheid van het actieve gen. Het tussen liggende chromatine met de inactieve ß-achtige genen vormt een lus. Bovendien zijn twee ver weg gelegen regulerende elementen, die 130 kb van elkaar liggen, ook betrokken bij deze interacties. Deze observaties laten zien dat lange afstand gen regulatie in vivo ruimtelijke interacties tussen verschillende regulerende elementen omvat terwijl het tussen liggende chromatine een lus vormt. Dit is in overeenstemming met het looping model. Deze ruimtelijke clustering van transcriptie regulerende elementen wordt een Actieve Chromatine Hub (ACH) genoemd. In hoofdstuk 6 wordt de structuur van het ß-globine locus in primitieve rode bloed cellen, waar de embryonale genen actief zijn terwijl de volwassen genen niet actief zijn, geanalyseerd. De resultaten laten zien dat een kern van de ACH, die de regulerende ß-globine elementen bevat, geconserveerd is terwijl de ß-globine genen hun interactie wisselen gedurende de ontwikkeling en dit correleert met de wisseling in transcriptionele activiteit. Het humane ß-globine locus, dat als transgen in de muis geïntroduceerd is, gedraagt zich op vergelijkbare wijze. In voorlopers van rode bloedcellen waarvan vaststaat dat ze ß-globine gaan expresseren maar dat nog niet doen, clustert een deel van de regulatieve elementen en vormt een structuur die Chromatine Hub (CH) genoemd wordt. Na differentiatie tot rode bloed cel wordt een volledig functionele ACH gevormd dat alle regulerende elementen en het actieve gen bevat. De rol die speciale eiwitten, transcriptie factoren genoemd, spelen in de formatie van de ß-globine ACH wordt behandeld in hoofdstuk 7. EKLF is een rode bloedcel speci. eke transcriptie factor die essentieel is voor de expressie van de volwassen ß-globine genen. In foetale levers van EKLF knock-out muizen wordt een structuur gevonden dat heel erg lijkt op de structuur die in de voorloper cellen is gevonden (een CH). Een EKLF eiwit gefuseerd met een ligand bindend domein werd geïntroduceerd om uit te sluiten dat deze observatie veroorzaakt wordt door het onvermogen van deze cellen om een secundair EKLF afhankelijk signaal te activeren. Dit fusie eiwit wordt vastgehouden in het cytoplasma en kan alleen als 4-hydroxy tamoxifen wordt toegevoegd naar de kern verhuizen. De ACH wordt dan weer gevormd en zelfs als tegelijkertijd de eiwit synthese geblokkeerd wordt, zodat secundaire effecten niet kunnen optreden, vindt ACH formatie plaats. Deze informatie laat zien dat EKLF nodig is voor de formatie en/of stabilisatie van een volledig functioneel ACH, en dat dit een primair effect is, terwijl CH formatie EKLF onafhankelijk is. In hoofdstuk 8 wordt voorgesteld dat de formatie van een ACH de sleutel vormt tot gen expressie in onderdrukkend chromatine en om hypersensitiviteit op genomische locaties te behouden. Het clusteren van regulerende elementen, mogelijk gemaakt door de af. niteit tussen eiwitten die gebonden zijn aan deze elementen, kan verklaren hoe overlappende gen loci afzonderlijke expressie patronen tot stand brengen. Ook wordt gesuggereerd dat de clustering van de regulatieve elementen en actieve genen essentieel is voor de hoge transcriptie niveau van de ß-globine genen. Transcriptie factoren bewegen zich snel door de kern terwijl ef.ciënte transcriptie een hoge locale concentratie van deze factoren op een genomische plek vereist. Locale accumulatie van trans-werkende factoren kan bewerkstelligd worden door de ruimtelijke clustering van hun bindings plaatsen. Daarom wordt gepostuleerd dat de ß-globine ACH gezien kan worden als een kern compartiment dat toegewijd is aan (RNA polymerase II) transcriptie van de ß-globine genen, zoals de nucleolus een kern compartiment is dat toegewijd is aan de RNA polymerase I transcriptie van rRNA genen.