Low-Molecular Weight Caldesmon in Glioma Neovascularization

Ondanks grote vooruitgang in neuroradiologische beeldvorming, neurochirurgische technieken, radiotherapeutische methodieken en de recente successen met chemotherapeutische behandeling van gliale tumoren, blijft de prognose van patienten met dergelijke tumoren, in het bijzonder de maligne gliomen, slecht. Daarom is het uitkiezen van onderzoeksvraagstellingen die relevantie hebben voor de kliniek van de patienten met gliomen, essentieel. Onderzoekonderwerpen die als doel hebben het ontdekken van tumor-gerelateerde factoren die diagnostiek verbeteren, beter voorspellen hoe het klinisch gedrag van de tumor zal zijn, of een goede maat zijn voor de reactie van de tumor op therapie, zijn derhalve favoriet. Er werden reeds verschillende van zulke tumor merkers ontdekt, maar geen van deze bleken tot dusver geschikt om in de klinische praktijk te worden toegepast. In Hoofdstuk 2 van dit proefschrift worden de experimenten beschreven om tumor-gerelateerde (of beter: tumor-specifieke) tumormerkers in hersenvloeistof van patienten met gliomen op te sporen. De eiwitten werden gezocht met behulp van 2-dimensionale electrophorese. Voor deze experimenten gebruikten we liquor cerebrospinalis omdat deze lichaamsvloeistof minder storende eiwitconcentraties bevat dan bijvoorbeeld in patientenserum aanwezig is. Hoge concentraties serum eiwitten als bijvoorbeeld albumine kunnen de eiwit spectra analyse met behulp van 2-dimensionale electrophorese vertroebelen en ook massaspectrometrie ter identificatie van de eiwitten, verstoren. Eiwitten hebben onderling verschillende fysische eigenschappen en dringen niet alle in dezelfde mate door tot in de liquor: factoren als post-translationele veranderingen (fosforylering en transaminering), massa en lading van de moleculen spelen daarbij een rol. Bovendien bestaan verschillende passieve en actieve transportmechanismen waarop eiwitten in de liquor kunnen belanden. De caldesmon eiwit spots in de gelen van de liquor van de glioom patienten waren specifiek en reproduceerbaar. Een ander eiwit, het N-myc, werd behalve in de liquor van de glioom patienten ook in liquoren van patienten met medulloblastomen gezien. Aankleuren van de 2-dimensionale gelen met Coomassie belemmert daaropvolgende analyse met behulp van MALDI niet, in tegenstelling tot aankleuring met zilveroplossingen, waarmee echter wel hogere sensitiviteit van detectie wordt bereikt. Inmiddels zijn verbeteringen in de techniek van 2-dimensionele electrophorese aangebracht, zoals het differentieel labelen van de te analyseren eiwitmengsels. Ook hebben de methoden en technieken van de massa spectrometrie zich snel geëvolueerd. Behalve MALDI zijn ook Q-tof en FT-MS voor massa spectrometrie beschikbaar gekomen. Niet in de laatste plaats, enorme vooruitgang in de bio-informatica heeft gezorgd voor steeds toenemende specificiteit en sensitiviteit van de bevindingen. Het screenen voor biomarkers in weefsels en lichaamsvloeistoffen voor identificatie van tumor-geassocieerde eiwitten is zich snel aan het ontwikkelen. Langs immunohistochemische weg konden we aantonen dat de expressie van het caldesmon eiwit in gliomen beperkt was tot de tumorvasculatuur. Ofschoon ook de vaten van normaal hersenweefsel positief aankleurden voor caldesmon, bleek de expressie steeds veel sterker in de tumorvaten te zijn, mogelijk door versterking (upregulation) van de gen expressie. In hoofdstuk 3 van dit proefschrift werd de verhoogde expressie gekwantificeerd en werd naar de oorzaak ervan nagegaan. Het bleek middels RT-PCR experimenten, waarbij de expressie van de verschillende splice-varianten van het caldesmon gen (CALD1) werd nagegaan, dat in de glioomvaten abnormale splicing van het caldesmon gen plaats vindt, die niet in de normale hersenvaten wordt gevonden. Het bleek dat exclusive expressie van de exonen 1, 1+4 en 1’+4 van het CALD1 gen optreedt in de tumorvaten. De eiwitproducten van deze alternatieve splicing behoren alle tot de laag-moleculaire klasse van het caldesmon, namelijk het Hela type l-CaD I en II, en WI-38 type l-CaD I. Tevens werd middels semiquantitatieve immunblotting experimenten aangetoond dat deze eiwitvarianten verhoogd, tot zo’n 3.5 maal, tot expressie komen. In hoofdstuk 4 werd de expressie van Hela l-CaD in de bloedvaten van gliale tumoren middels een specifiek anti-Hela l-CaD antilichaam verder gedetailleerd. Er worden verschillende vormen en stadia van angioneogenese onderscheiden, en de expressie van Hela l-CaD tegen die achtergrond bestudeerd. Het bleek dat de expressie vooral in vroege stadia van angioneogenese in de gliomen wordt gezien. De individueel infiltrerende endotheliale cellen en celclusters, en ook endotheliale voorlopercellen, toonden alle sterke expressie van Hela l-CaD. Er werd ook expressie in endotheelcellen in nieuwe spruiten van pre-existente vaten gevonden. In late fasen van angioneogenese, gerepresenteerd door vaten met zich opsplitsende wanden, en fibrosering en hyalinisering van de wand, werd nauwelijks of geen expressie meer aangetroffen. In hoofdstuk 3 werd al waargenomen dat overexpressie van l-CaD was gecorreleerd met afname van de expressie van de eiwitten occludine en ZO-1, die deel uitmaken van tight junctions tussen de endotheelcellen. Daarmee is een verband gelegd tussen de functionele status van de cellen en de aberrante expressie van caldesmon. Om de functionele betekenis van de abnormale expressie van caldesmon in de individueel infiltrerende endothliale cellen vast te stellen, werden filamenten in deze cellen, die betrokken zijn bij cel-cel interacties, middels confocale microscopie bestudeerd. Daarbij werden veranderingen vergeleken met eigenschappen van cellen met verhoogde motiliteit, zoal beschreven in celkweken in de literatuur. In de Hela l-CaD-positieve endotheliale cellen werd redistributie van het eiwit vinculine, en werden veranderingen van het F-actine, een filament-gebonden eiwit, vastgesteld. De bevindingen zijn sterk suggestief voor een verband tussen de abnormale expresie van l-CaD enerzijds, en de vorming van zogenaamde podosomen, anderszijds. Podosomen worden beschouwd als tijdelijke adhesies tussen cellen die een sterke motiliteit tonen. Het bleek dat een redistributie van verschillende eiwitten optreedt, en conformatie van op podosomen gelijkende structuren voorkomt in de individuele cellen die zowel in de gliale tumoren, als in de infiltratieranden van de tumoren, worden gezien. Deze cellen zijn sterk positief voor het Hela l-CaD-specifieke antilichaam. Met behulp van confocale microscopie verricht op cellen die voor verschillende eiwitten simultaan werden gekleurd, werden aanwijzingen verzameld die erop duiden dat focale adhesies ontbonden worden en in plaats daarvan op podosomen gelijkende structuren verschijnen. De cellen waarbij dit optreedt behoeven in toekomstig onderzoek aandacht. Waar komen deze CD31, CD34-positieve cellen vandaan? Zijn ze afkomstig uit het beenmerg? Wat is hun relatie met de stamcellen die inmiddels in gliomen zijn geidentificeerd en naar de tumoren toe migreren? Of zijn het tumorcellen die zich in neoplastische endotheelcellen hebben getransformeerd? Omdat gliomen zo rijk gevasculariseerd zijn, en alle typen en fasen van neoplastisch angiogenese in de gliale tumoren aanwezig zijn, vormen ze een ideaal substraat voor de bestudering van neoangiogenese. Om de vraag te beantwoorden, of de abnormale expressie van het laag-moleculaire caldsmon beperkt is tot de vasculatuur van gliale tumoren, of ook in bloedvaten van andere tumoren voorkomt, werd in hoofdstuk 5 de expressie van caldesmon in een grote groep niet-gliale tumoren bestudeerd. Tumoren van long, borst, colon, maag, lever, nier, schildlier, endometrium, prostaat, blaas en ovarium werden aan immunohistochemische kleuringen voor het Hela-type l-CaD onderworpen. De individueel infiltrerende endotheelcellen en endotheliale celclusters werden in sterk wisselende mate in deze tumoren gevonden. De expressie van Hela l-CaD bleek ook sterk per tumortype te varieren. Net als bij de gliomen werden met behulp van confocale microscopie ook de eigenschappen van sterk mobiele cellen gevonden in de Hela l-Cad-positieve endotheliale cellen. In tegenstelling tot de situatie bij de gliomen echter, werden in enkele borst- en schilkliertumoren ook niet-endotheliale, l-CaD-positieve tumorcellen, en ook niet-neoplastische epitheliale cellen, geidentificeerd. De betekenis daarvan blijft vooralsnog onduidelijk. De consequentie van deze bevinding is dat het ontwikkelen van op abnormale expressie van caldesmon-gerichte anti-angiogenetisch therapie, bij zulke tumoren uitgesloten is. In het laatste hoofdstuk van dit proefschrift werd weer teruggegrepen naar de allereerste bevinding, namelijk de specifieke aanwezigheid van caldesmon in de liquor cerebrospinalis van patienten met een gliale tumor. Onderzocht werd of een verhoogde caldesmonspiegel ook in het serum aanwezig is, waarmee een eerste stap in de richting van het ontwikkelen van caldesmon als specifieke tumor merkerstof gezet is. De serum-caldesmon spiegel werd gemeten in een groep van 230 mensen, die bestond uit 57 patienten met een glioom, en 107 patienten met niet-gliale CZS tumoren, 36 patienten met neurologisch aandoeningen zonder tumor, en 30 gezonde mensen. De caldesmon serumspiegel van de glioompatienten bleek significant hoger te liggen in vergelijking tot die van de andere groepen (specificiteit 84%; sensitiviteit 91%). Deze bevindingen wijzen op de noodzaak van een nieuwe studie waarbij het serum caldesmon moet worden gemeten in situaties van patienten met een intracraniele tumor, maar bij wie de radiologie niet eenduidig voor een glioom is. Tevens is het vervolgen van de caldesmon serumspiegel van patienten na behandeling, bij vervolgen van de tumor en het monitoren van de ziekte, aangewezen, om de waarde van het serum caldesmon voor de klinische praktijk te toetsen. Curriculum Vitae and Publications

• View at Worldcat

Free Full Text ( Final Version , 3mb )