Identification, function and clinical relevance of myeloid leukemia genes

Acute myeloïde leukemie (AML) wordt geclassificeerd in verschillende risico categorieën op basis van cytogenetische en moleculaire afwijkingen. De chromosomale translocaties t(8;21), t(15;17) en inv(16) bijvoorbeeld, resulteren in fusie-eiwitten met afwijkende transcriptioneel regulerende activiteiten en worden geassocieerd met een relatief gunstige prognose, terwijl 3q26, 5q, 7q en 11q23 afwijkingen correleren met een verminderde overlevingskans na behandeling. Mutaties in het gen dat codeert voor de transcriptiefactor CCAAT bindend eiwit alpha (CEBPA) en de goeifactor receptor FMS-like tyrosine kinase3 (FLT3) zijn tevens geassocieerd met respectievelijk een goede en slechte prognose. Ongeveer de helft van de AML patiënten heeft bekende (cyto-) genetische afwijkingen. De ontwikkeling van AML is een meerstapsproces waarbij defecten in meerdere genen betrokken zijn. Dit is vooral duidelijk geworden in studies in muizenmodellen. Zo ontwikkelen muizen die fusiegenen herbergen afkomstig van t(15;17), t(8;21) en inv(16) pas na langere tijd en met een lage frequentie leukemie, hetgeen aangeeft dat additionele afwijkingen nodig zijn voor volledige transformatie van hematopoietische voorlopercellen in AML cellen. Algemeen wordt aangenomen dat AML ontstaat door afwijkingen van combinaties van genen die hematopoietische stamcel proliferatie, vernieuwing en myeloïde differentiatie controleren. De beschikbaarheid van de sequentie van het muizengenoom heeft van retrovirale mutagenese een krachtige strategie gemaakt voor de identificatie van nieuwe ziektegenen die betrokken zijn bij diverse typen kanker, waaronder met name leukemie, lymfoom en borstkanker. Voor de identificatie van genen die voornamelijk een rol spelen in acute myeloïde leukemie (AML) hebben we Graffi-1.4 (Gr-1.4) muizen leukemievirus (MLV) gebruikt. Hiervoor zijn pasgeboren muizen subcutaan geïnjecteerd met Gr-1.4 virus. Al deze muizen ontwikkelden na 4-6 maanden een leukemie, voornamelijk van myeloïde origine (Hoofdstuk 2 en 4). Voor de identificatie van de virus-flankerende genen hebben we inverse PCR technologie gebruikt en gecombineerd met geautomatiseerde sequentie analyse. Met deze methode zijn meer dan 100 kandidaat ziektegenen geïdentificeerd die betrokken zijn in meerdere mechanismen, zoals bijvoorbeeld DNA herstel (Rad54/SNF2, Rad3­related), regulering van het niveau van reactieve zuurstof deeltjes (ROS)(Txnip, PrdxII) en geprogrammeerde celdood (Api-5) (Hoofdstuk 2). De meeste virus­flankerende genen maken deel uit van signaal transductie en transcriptionele netwerken (Hoofdstuk 2). Deze resultaten overlappen deels met die van andere MLV mutagenese studies. Zo werden bijvoorbeeld p53, Notch-1, Fli-1 en Evi-1 ook in eerdere screens gevonden. Deze genen zijn dus waarschijnlijk betrokken bij meerdere typen muizen leukemie. Daarnaast hebben we genen ontdekt die waarschijnlijk meer specifiek betrokken zijn bij myeloïde leukemie (Hoofdstuk 2). Genen die in meerdere onafhankelijke mutagenese screens zijn gevonden zijn zeer waarschijnlijk belangrijk voor het ontstaan van leukemie in de muis. Het belang van deze genen voor humane leukemie staat daarmee echter niet vast. Bovendien kan een retrovirus de expressie van een targetgen over een afstand van enkele honderden kilobasen beïnvloeden. Dit bemoeilijkt een strikte definitie van een virus targetgen op basis van de plek van integratie. In hoofdstuk 3 hebben we geprobeerd dit probleem te benaderen door verschillende groepen potentiële targetgenen, dichtbij of verder weg gelokaliseerd van de virusintegratieplek, te vergelijken met genen die differentieel tot expressie komen in subgroepen van AML. We vonden dat muizen leukemiegenen geïdentificeerd met retrovirale insertionele mutagenese differentieel tot expressie komen in subgroepen van AML bij zowel volwassenen als kinderen. Genen die direct grenzen aan de plek van virusintegratie correleerden significant met groepen van genen die verantwoordelijk waren voor classificatie van humane leukemie. Dit in tegenstelling tot genen die verderop liggen. Dit resultaat laat zien dat genen die het dichtst in de buurt liggen van virus integraties hoogst waarschijnlijk ook ziektegenen zijn met een rol in AML bij de mens. Deze genen konden geplaatst worden in vijf regulatoire netwerken. In dit proefschrift is de functionele rol van drie van dergelijke genen nader onderzocht; te weten de genen die coderen voor de transcriptiefactor Yin Yang 1 (Yy1), WD40-repeat domein en een SOCS box-2 (Wsb-2) en Thioredoxin bindend eiwit (Txnip). In hoofdstuk 4 wordt beschreven dat Gr-1.4 integraties in de Yin Yang 1 (YY1) promoter regio YY1 expressie dereguleren en het onafhankelijk maken van regulatie door Sp1. Bovendien had kunstmatig verhoogde YY1 expressie een negatief effect op de differentiatie van myeloïde 32D cellen en voorkwam de uitgroei van myeloïde voorlopercellen vanuit primaire beenmerg cellen. Verder hebben we gevonden dat in een bepaalde groep van AML patiënten de YY1 expressie significant verhoogd is ten opzichte van normale beenmergcellen. Deze resultaten maken aannemelijk dat verstoorde regulatie van YY1 expressie interfereren met normale differentiatie programma van myeloïde voorlopercellen en daardoor kan bijdragen aan de ontwikkeling van leukemie. Hoofdstuk 5 handelt over het gen dat voor een WD40-repeat domein en een SOCS box-2 (Wsb-2) codeert. Virusintegraties in Wsb-2 werden uitsluitend gevonden tussen exon 4 en exon 7, wat aangeeft dat het Wsb-2 gen waarschijnlijk geïnactiveerd wordt door de integraties. Ook bij een subgroep in humane AML werd gevonden dat het Wsb-2 mRNA niveau sterk verlaagd is. Wsb-2 blijkt te binden aan het distale domein van de G-CSF-R, een domein betrokken bij ernstige aangeboren neutropenie, myelodysplastisch syndroom (MDS) en AML. Verder vermindert Wsb­2 G-CSF-R membraan expressie en G-CSF-geïnduceerde STAT activatie en proliferatie signalen. Dit duidt erop dat Wsb-2 een tumoronderdrukkende werking uitoefent door remming van G-CSF geïnduceerde proliferatie van myeloïde voorlopercellen. In hoofdstuk 6 worden de gegevens van integraties in het Txnip gen beschreven. Integraties in Txnip vonden plaats in de 5' en 3' regio in 100% van de Gr-1.4 en 58% van de CasBrM geïnduceerde leukemie gevallen. Integraties in deze regio's resulteren in een verhoogd signaal in luciferase assays, vergeleken met een normale Txnip promoter. TXNIP mRNA niveaus blijken te zijn verhoogd in een groep van AML patiënten ten opzichte van CD34+ normale beenmergcellen. Kunstmatige verhoogde expressie van TXNIP resulteerde in een versnelde geprogrammeerde celdood en vertraagde celdeling.